如何预防PCR 实验防污染

夕阳璃惜

如何预防PCR 实验防污染
来源：Eppendorf实验室


　　PCR 实验污染和细胞污染是有差别的，PCR 实验污染主要是核酸而不是细菌和其他入侵者。因此所有的预防措施都会稍稍有所不同。


　　PCR 实验预防污染关键就在于对每个步骤进行严格分区啦，这个不必多说。


　　试剂配制区、样品处理区、核酸扩增区和产物分析室的顺序，依次来说说哪些问题需要重点盯防。


　　试剂配制区


　　试剂配置区，看上去很简单，操作也很重复。如果在试剂配制阶段，就产生污染的话，预示着实验员将完整地浪费一次实验时间。


　　所以，在试剂配置区，移液工具和溶液都要定期消毒。


　　枪头要及时更换


　　试剂管的盖子要及时盖上


　　不管有没有可疑的污染源，在试剂配置区，都要定期检查污染情况，这样才能及时发现问题所在。


　　核酸提取区


　　实验员最常用的核酸提取，就是用商品化核酸提取试剂盒来手工提取。而且在这个过程中，要涉及到多次加液、转移、离心操作，可谓是雷点重重。


　　在核酸提取中，试剂通常会存在有机组分，会产生漏液滴液现象。


　　而离心过程中，样品里的细菌、细胞、血液之流，还有可能随着离心机，变成气溶胶，在空气中四处飘荡，威胁着生物民工的生命安全。


　　当实验室充满了危险物质和污染源的时候，大咖选择另开一个楼层，重建一个实验室。而普通实验员该怎么做呢?


　　加液和移液时


　　升级移液技术，就能有效地防止在加液和移液时，发生滴液、漏液，进而污染工作台和其他样本。比如移取含挥发性有机溶液的试剂时，我们可以进行预润洗或者更换适配性好的吸头。


　　另外，把移液器换成分液器能显著地改善滴液漏液的情况。


　　离心时


　　当小心翼翼地安置好试剂，等待离心结束，期待满满地打开离心机盖子的时候，却发现一个破碎的离心管，整个画面真是令人心碎。


　　离心管破碎，免不了又开始洗洗洗


　　因此离心的时候，还是要选择质量可靠的离心管。


　　






　　而藏污纳垢重灾区之一——离心机的转子和吊篮，也要选择便于高温杀菌消毒的那种，这样，就可以节约很多消毒清洁的时间啦。


　　实验全程控制


　　在实验的过程中，增加空白提取对照或阴性样本提取对照，对核酸提取过程和实验环境进行控制。


　　核酸扩增区和产物分析区


　　这两个区域涉及 PCR 实验的准备、运行以及 PCR 产物的分析。PCR 实验因为十分敏感而备受欢迎，不过这个敏感的优势，也同样放大了污染。极其微量的污染，就可能反手摔一个假阳性结果给你。


　　而且 PCR 实验中，运行中的电泳池附近，会有大量 DNA 扩散，一旦出现气溶胶污染，就真是又要关闭实验室了。


　　在这个区域当中，主要的污染集中在 3 个地方：


　　模板间交叉污染：


　　主要是在取样加样的过程中，由于移液器之间的交叉形成的污染。


　　移液器所造成的污染，如果是表面的话可以经常使用 70% 的酒精进行擦拭，而内部造成的污染，因为消毒清洁比较困难，所以最好选用集吸液放液脱卸吸头于一键的移液器。


　　吸头中的滤芯，也能够阻止气溶胶扩散，防止污染的产生。


　　




PCR 试剂的污染：


　　主要是在 PCR 组分试剂加样过程中，由于移液器、容器、阴性对照及其它试剂被核酸模板或阳性对照污染。


　　加样过程中，因为 PCR 试剂对温度十分敏感，需要通过冰浴使得 PCR 试剂和 PCR 板/管处于 0℃，但这个过程也是充满了污染的风险的。


　　而改用 PCR-Cooler 低温指示冰盒和 IsoTherm-System 冰盒系统，就可以不用再通过冰浴避免污染风险，保证样品和试剂的安全了。


　　PCR 扩增产物污染：


　　这是 PCR 反应中最主要最常见的污染问题。因为 PCR 产物拷贝量大，远远高于 PCR 检测数个拷贝的极限，所以极微量的 PCR 产物污染，就可形成假阳性。


　　每一项准备工作没有做好，都会影响到扩增产物区，因此，想要顺利地出结果，文中提到的注意点，都要小心谨慎地对待。


　　另外，降低 PCR 实验的频率也能降低被污染的风险。能一次做 50 个，不要分开 5 次每次做 10 个。不用频繁做 PCR 实验，实验数据也更好看。


　　总结了两条十分有用的小诀窍：


　　● 面对多份样品，制备反应混合液时，先将 dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后用分液功能进行分装。


　　● 在加入模板时，按照“阴性对照-待测样品-阳性对照”的加样顺序，操作上应遵循“开管盖-加模板-盖管盖”的原则。