有关菌种方面的一些知识

行走江湖

所购菌种均为冷冻干燥菌种。
采购部门购入菌种后，应及时移交实验室。实验室菌种管理人员应仔细核对菌种发放单和冷冻干燥菌种管标签等各项信息，确认无误后，置4～6℃暂存。
菌种的复苏
菌种在打开前应仔细核对标签上菌名、菌号。并注意一株菌种使用一套打开用具，严防交叉污染。
菌种复苏应在生物安全柜内操作。
大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门菌、生孢梭菌和白色念珠菌可同时接种液体培养基和琼脂培养基斜面，枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、藤黄微球菌和黑曲霉可接种琼脂培养基斜面。
取琼脂培养基斜面上的菌苔按要求对菌种的纯度进行鉴定。

菌种的传代
应在生物安全柜中进行菌种的传代 。
取经过纯度鉴定的第1代菌种管（琼脂培养基斜面培养物）用于传代制备第2代菌种。
接种完毕，液体培养基或琼脂培养基斜面应在规定的温度下培养适宜的时间，芽孢杆菌宜培养5～6天，黑曲霉宜培养5～7天，其他菌种一般培养18～24小时。

菌种的保藏
保存的容器为无菌冻存管，保藏温度为-70℃。
在冷冻前，应贴上菌种标签。标签内容应包括菌名、菌号、传代日期和有效期。
所有冻存管应立即置低温冰箱中，迅速冷冻。
该方法保藏菌种的有效期规定为6个月 。

菌种的使用和销毁
本所保藏的菌种主要供本所检验工作使用并可对外提供给有关涉药单位。本所提供的菌种为第二代低温冷冻菌种。
本所检验工作所需菌种，领用人应向菌种管理人员领取，并在《菌种领用记录》上记录菌名、数量、领用人等信息。
外单位向我所购买菌种，应凭单位介绍信，并注明菌名、菌号、数量，必要时可预约购买。
本所保藏的菌种，一般应每年更换原种（每年打开一套冷冻干燥菌种传代制备第1代原种保存）。
过期菌种应及时销毁，销毁时应经121℃ 20分钟的生物灭活处理。
通过制备工作菌种进行菌种保藏的方法
从我所采购超低温冷冻的标准储备菌株（第二代）
将所购菌株置4～6℃暂存，并尽快制备工作菌种

准备足够数量的琼脂斜面培养基
在生物安全柜内取标准储备菌株1接种环，划线接种至斜面上，重复操作直至所有斜面均被接种
将所有斜面培养基置适宜的温度培养适宜的时间
观察培养的情况，取其中1支进行镜检和必要的确认实验
确认符合要求的工作菌种进行必要的标识，置4～6℃保藏（第三代）
在规定的保存期内，取上述斜面培养物用于各种实验
至失效期前，取其中1支重复接种斜面培养基，制备第四代工作菌种
通过制备工作菌种进行菌种保藏的方法
优点
操作简便
成本低
比较容易掌握
缺点
保存期比较短
反复传代有引起变异的可能
通过制备标准储备菌种进行菌种保藏的方法
准备低温冰箱，温度应能达到-30℃，最好能够装备超低温冰箱，温度达到-70℃
准备适宜的液体培养基
将采购来的标准储备菌株在生物安全柜内吸取适量接种至液体培养基中
将培养基置适宜温度培养适宜时间
取适量培养物进行镜检和必要的确认实验
确认符合要求后，在生物安全柜内，向上述液体培养物中加入15～20％（V/V）的无菌甘油，混匀
取1～2ml上述混合物，置无菌冻存管或无菌离心管内
进行必要的标识
置低温冰箱中冷冻
取冻存管1支，解冻后，制备当月使用的工作菌种
通过制备标准储备菌种进行菌种保藏的方法
优点
保存期较长
反复传代导致菌种变异的风险较小
缺点
操作相对复杂
成本较高
操作流程相对较长，受到污染的风险较高
有关菌种问题的答复
阳性菌的制备：领取工作菌种，从斜面上取一定量的培养物，稀释至系列梯度的菌悬液，分别测各梯度菌悬液的菌落数。临用时，取相应稀释菌悬液用于阳性试验，同时用平皿法测定加入的菌液中的菌落数。是否可行？
对照用菌液的制备应取工作菌种，接种置适宜的液体培养基中，经培养后获得浓菌液，再进行稀释和确定菌浓度
菌种鉴定
简单的讲可以采用目前比较成熟的商品化鉴定技术，如API鉴定条
基本程序为：
对疑似菌种进行纯培养
进行染色镜检
根据染色情况，并结合显色培养基等鉴定的初步信息，选择合适的鉴定条
根据操作说明书，得到各生化反应的鉴定结果，通过查阅检索表，得到菌种鉴定的初步结果
也可以采用半自动或全自动的微生物鉴定系统

请教黑曲霉及白色念珠菌具体传代及培养技术，操作中有何注意点？
采用的培养基应为改良马丁琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基
传代操作建议在生物安全柜内进行
白色念珠菌
斜面培养基的传代：取斜面培养的菌种管，用接种环取1白金耳，在待接种的培养基斜面上划线接种，培养即可
液体培养基的传代：取液体培养的菌种管，用毛细吸管取适量，在待接种的培养基斜面上涂布接种，培养即可
培养条件：20～25℃，24小时
黑曲霉
斜面培养基的传代：取斜面培养的菌种管，用灭菌水或灭菌生理盐水（也可以按照2010年版药典公示稿的方法）3～5ml洗脱孢子，吸取孢子悬液，在待接种的培养基斜面上涂布接种，培养即可
孢子悬液的传代：取孢子悬液，用毛细吸管取适量，在待接种的培养基斜面上涂布接种，培养即可
培养条件：20～25℃，4～5天
注意点
减少形成气溶胶的操作
佩戴手套和口罩进行操作
生孢梭菌计数：用营养琼脂培养基倒皿，厌氧罐培养长不出来，经确认菌是有活性的，厌氧指示颜色正确，-5，-6，-7均无菌落生长
对于生孢梭菌的计数，建议将所有稀释级均注皿培养
培养中的厌氧环境对生长与否是决定性的
有条件的实验室建议采用厌氧培养工作站
小型的厌氧培养可采用厌氧培养罐，但应严格按照使用说明操作，注意厌氧试剂、厌氧指示剂、催化剂的有效性

该贴已经同步到 行走江湖的微博