APP

药智论坛

查看: 412|回复: 0

蛋白双向电泳

[复制链接]
发表于 2022-5-12 15:04:15 | 显示全部楼层 |阅读模式

蛋白质组研究的发展以双向电泳技术作为核心。 双向电泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分离约1 000个E.coli蛋白,并表明蛋白质谱不是稳定的,而是随环境而变化。 双向电泳原理简明,第一向进行等电聚焦,蛋白质沿pH梯度分离,至各自的等电点;随后,再沿垂直的方向进行分子量的分离。 目前,随着技术的飞速发展,已能分离出10000个斑点(spot)。 当双向电泳斑点的全面分析成为现实的时候,蛋白质组的分析变得可行。

样品制备(sample prepareation)和溶解同样事关2-DE的成效,目标是尽可能扩大其溶解度和解聚,以提高分辨率。 用化学法和机械裂解法破碎以尽可能溶解和解聚蛋白,两者联合有协同作用。 对IEF(isoelectric focusing)样品的预处理涉及溶解、变性和还原来完全破坏蛋白间的相互作用,并除去如核酸等非蛋白物质。

理想的状态是人们应一步完成蛋白的完全处理。 而离液剂2 mol/L硫脲和表面活性剂4%CHAPS的混合液促使疏水蛋白从IPG(immobilized pH gradients)胶上的转换。三丁基膦(Tributyl phosphine,TBP)取代β-巯基乙醇或DTT完全溶解链间或链内的二硫键,增强了蛋白的溶解度,并导致转至第二向的增加]。 两者通过不同的方法来增加蛋白的溶解度,作为互补试剂会更有效。

在保持样品的完整性的前提下,可利用超离和核酸内切酶去除核酸(DNA)。 除此之外,机械力被用来对蛋白分子解聚,如超声破碎]等。 另外,添加PMSF等蛋白酶抑制剂,可保持蛋白完整性。 由于商品化的IPG胶条是干燥脱水的,可在其水化的过程中加样,覆盖整个IPG胶,避免在样品杯中的沉淀所致的样品丢失]。 此外,低丰度蛋白(low abundance protein)在细胞内可能具有重要的调节功能,代表蛋白质组研究的“冰山之尖”,故分离低丰度蛋白是一种挑战。

亚细胞分级和蛋白质预分级、提高加样量(已达到1~15 mg级的标准)、应用敏感性检测,可以提高其敏感性。 如一种多肽免疫2-DE印迹(MI-2DE)是利用几种单克隆抗体技术来分析和检测。 提高组蛋白和核糖体蛋白等碱性蛋白(basic proteins)的分离是另一难点。 由于碱性pH范围内凝胶基质的不稳定及逆向电渗流(EOF)的产生,对PI(等电点)超过10的碱性蛋白,通过产生?0~10%?的山梨醇梯度和16%的异丙醇可减少之。 亦可用双甲基丙烯酰胺来增加基质的稳定性。


您需要登录后才可以回帖 登录 | 免费注册

本版积分规则

QQ|论坛规则|(渝)-经营性-2016-0011|渝B2-20120028|药智论坛 ( 渝ICP备10200070号-3

渝公网安备 50010802004459号

GMT+8, 2022-5-21 03:33

快速回复 返回顶部 返回列表