蛋白双向电泳

萌萌哒兔1126

蛋白质组研究的发展以双向电泳技术作为核心｡ 双向电泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分离约1 000个E.coli蛋白,并表明蛋白质谱不是稳定的,而是随环境而变化｡ 双向电泳原理简明,第一向进行等电聚焦,蛋白质沿pH梯度分离,至各自的等电点;随后,再沿垂直的方向进行分子量的分离｡ 目前,随着技术的飞速发展,已能分离出10000个斑点(spot)｡ 当双向电泳斑点的全面分析成为现实的时候,蛋白质组的分析变得可行｡

样品制备(sample prepareation)和溶解同样事关2-DE的成效,目标是尽可能扩大其溶解度和解聚,以提高分辨率｡ 用化学法和机械裂解法破碎以尽可能溶解和解聚蛋白,两者联合有协同作用｡ 对IEF(isoelectric focusing)样品的预处理涉及溶解､变性和还原来完全破坏蛋白间的相互作用,并除去如核酸等非蛋白物质｡

理想的状态是人们应一步完成蛋白的完全处理｡ 而离液剂2 mol/L硫脲和表面活性剂4%CHAPS的混合液促使疏水蛋白从IPG(immobilized pH gradients)胶上的转换｡三丁基膦(Tributyl phosphine,TBP)取代β-巯基乙醇或DTT完全溶解链间或链内的二硫键,增强了蛋白的溶解度,并导致转至第二向的增加]｡ 两者通过不同的方法来增加蛋白的溶解度,作为互补试剂会更有效｡

在保持样品的完整性的前提下,可利用超离和核酸内切酶去除核酸(DNA)｡ 除此之外,机械力被用来对蛋白分子解聚,如超声破碎]等｡ 另外,添加PMSF等蛋白酶抑制剂,可保持蛋白完整性｡ 由于商品化的IPG胶条是干燥脱水的,可在其水化的过程中加样,覆盖整个IPG胶,避免在样品杯中的沉淀所致的样品丢失]｡ 此外,低丰度蛋白(low abundance protein)在细胞内可能具有重要的调节功能,代表蛋白质组研究的“冰山之尖”,故分离低丰度蛋白是一种挑战｡

亚细胞分级和蛋白质预分级､提高加样量(已达到1~15 mg级的标准)､应用敏感性检测,可以提高其敏感性｡ 如一种多肽免疫2-DE印迹(MI-2DE)是利用几种单克隆抗体技术来分析和检测｡ 提高组蛋白和核糖体蛋白等碱性蛋白(basic proteins)的分离是另一难点｡ 由于碱性pH范围内凝胶基质的不稳定及逆向电渗流(EOF)的产生,对PI(等电点)超过10的碱性蛋白,通过产生?0~10%?的山梨醇梯度和16%的异丙醇可减少之｡ 亦可用双甲基丙烯酰胺来增加基质的稳定性｡