MMPL3 蛋白的晶体结构,MMPL3 抑制剂有望治疗结核病 | MedChemExp...

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MMPL (Mycobacterial membrane proteinLarge) 是分枝杆菌基因组编码的一组膜蛋白，属于 RND 蛋白家族，在脂质、聚合物和免疫调节剂的运输过程中发挥重要作用，也是近年来出现的重要的 TB 治疗药物靶点之一。结核分枝杆菌（Mtb）编码 13 种 MMPL 蛋白，其中 MMPL3、4、5、7、8、10 和 11 已被证实参与分枝杆菌细胞膜的生物合成。MMPL3 是其中被认为是细菌（包括 Mtb）细胞复制和存活必不可少的分子。近日，来自上海科技大学免疫化学研究所的一项研究报道了分枝杆菌 MMPL3 蛋白以及 4 种候选结核病治疗药物的晶体结构。MMPL3 由质孔结构域和 12 螺旋跨膜结构域组成。位于跨膜结构域中心的 Asp-Tyr 对似乎是质子传递的关键促因子。SQ109、AU1235、ICA38 和Rimonabant 能够在跨膜结构域内结合并破坏这些 Asp-Tyr 对。这些结构数据的披露将极大地促进 MMPL3 抑制剂作为新型结核治疗药物的开发。

作者首先解析了单独的 MMPL3 分子的晶体结构（图1A）。MMPL3 的总体结构中，PN 和 PC 结构域是它的胞外可溶区，是质孔结构域的两个亚结构，PC 和 PN均是 β-α-β-α-β 的折叠方式。两者相互缠绕，形成一个中央腔，连接到三个开口，GT、GF 和 GB，亲水氨基酸的存在，可允许特定的分子进出。跨膜结构域（TMN/TMC）共包含 12 个跨膜螺旋（图 1B 和 C），TMH IV 和 TMH X 构成跨膜螺旋束的核心区域。在这两个螺旋之间，有两对亲水残基（Asp256-Tyr646和Asp645-Tyr257），它们间的氢键连接两个螺旋。值得注意的是，MMPL3 的 Asp-Tyr 突变能够使分枝杆菌在培养基中停止生长分裂。这一结论和 MMPL 在质子传递中的重要作用具有一致性。        

Figure 1.  来自耻垢分支杆菌 MMPL3 蛋白的总体结构

随后，研究团队分别解析了MMPL3 蛋白与四种抑制剂（SQ109、AU1235、ICA38 和 Rimonabant）复合物结合的晶体结构，通过 MST（microscale thermophoresis）实验测得 SQ109、AU1235、ICA38 和 Rimonabant 四种抑制剂和 MMPL3 蛋白结合的 Kd 值分别是 1.65 μM、0.29μM、0.16 μM 和 29.5 μM。

SQ109 是很有潜力的抗结核药物，具有广谱的抗菌活性，对结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌的MIC 值分别为 0.3-0.6 μM 和 9.6 μM，目前已完成临床 II-III 期试验。研究证实了 MMPL3 是 SQ109 的直接靶点，SQ109 作用于 MMPL3 蛋白的跨膜结构域，嵌入 TMH 束中心，被 TMH IV、V、VI、X、XI、XII 所包围（图2A），破坏质子传递中的 Asp-Tyr 对，阻断该蛋白的质子内流通道，导致 MMPL3 的构象重排（图2）。

Figure 2. SQ109 结合后引起 MMPL3 的构象重排

AU1235 对分枝杆菌和耻垢分枝杆菌的 MIC 值分别为 0.6 μM 和9.8 μM。研究发现 AU1235 与 SQ109 在同一个口袋中结合。此外， AU1235 的结合模式与 SQ109 的结合模式相似。在结合时，AU1235 在 MMPL3 中诱导了与 SQ109 非常相似的构象变化。两个抑制剂和 MMPL3 蛋白结合的差异在于 AU1235 中的 Three fluorinatedphenyl 具有更强的疏水作用。

ICA38 对分枝杆菌的 MIC 值为 0.003 μM。由于 ICA38 的生物利用度较差，不适合作为候选药物进一步开发，其衍生物 NITD-304 和 NITD-349 已被证明是很有潜力的治疗耐药结核病的临床前候选药物。研究发现，ICA38 结合 MMPL3 的模式和AU1235、SQ109 相似。与 AU1235 和 SQ109相比，ICA38 的吲哚基团紧贴在通道顶部的疏水亚位点，产生的疏水作用强于 SQ109 和 AU1235。

作者还对成药库的药物分子进行了筛选，惊喜发现 Rimonabant 有可能是 MMPL3 蛋白的抑制剂。Rimonabant 是针对 CB1 的拮抗剂，具有治疗肥胖症的潜力。通过分析 Rimonabant 与 MMPL3 蛋白复合物的晶体结构，作者证实了 MMPL3 蛋白是 Rimonabant 的直接靶点。结构显示，Rimonabant 阻断了 MMPL3 的质子内流通道。

为了更加清楚形象的解释Rimonabant 的结合模式，作者将 Rimonabant 的 2, 4-dichlorobenzyl ring 简称为“臂1”，4-chlorophenyl ring 简称为“臂2”，哌啶酰-1-氨基甲酰简称为“臂3”（图 3D）。吡唑环(包括4-甲基)插入 TMH 束的中心，垂直于膜，与疏水残基 Gly641、Leu642 和Ile253 相互作用（图 3C 和 D）。“臂1”占据了一个由 5 个脂肪族氨基酸侧链包围的疏水口袋（图 3C 和 D）。“臂2”与 SQ109 的香叶尾方向不同，伸入邻近的、由 Val245、Ile319、Val638和 Leu708 侧链形成的疏水亚位点（图3 A、C 和 D）。“臂3”插入两个 Asp-Tyr 对的中心，并通过与 Asp645 形成极性相互作用而破坏连接它们的氢键。当 Phe649 的苯环向下旋转面向 Phe260 的芳香环时，Phe260 几乎不受干扰，形成 π-π 相互作用（图3C 和 E）。Rimonabant 与 MMPL3蛋白的这种结合模式不同于 SQ109 等抑制剂，与结合 CB1 受体的模式也极其不同。

Figure 3.  Rimonabant 与 MMPL3 结合的独特模式

SQ109、AU1235、ICA38 和 Rimonabant 这四种抑制剂均结合在质子传递通道中，该研究对这个结合口袋进行了分区，分为 S1、S2、S3、S4 和 S5 五个亚区。其中，SQ109、AU1235 和 ICA38 结合模式相似，占据了 S3、S4、S5 三个亚区 (图7B-D)，而Rimonabant 比较特别，它还占据了 S1 和 S2 亚区 (图 4E)。这种药物结合的结构特点，对于抑制 MMPL3 这一靶点蛋白的抗结核药物设计具有非常重要的指导作用。除了 S4 亚位点外，S1、S2、S3、S5 都是疏水的。S1 和 S2 相对较小，而 S3 和 S5 都比较大，足以容纳大型疏水基团以增强结合(图 4A)。这两个 Asp-Tyr 对是 S4 亚位点的关键组件 (图 4A)。四种候选药物在结合时分别占据质子传递通道的 3-5 个子位点 (图 4B -4E)，破坏质子传递通道中的 Asp-Tyr 对，从而阻断底物转运的质子动力。图中结构信息的展示代表针对 MMPL3蛋白有效抑制剂设计的一个重大进展。重要的是，这些结构数据和 MMPL3 活性化合物的 Kd 值表明，这些活性化合物在成为高效抗结核药物之前还有很大优化空间。

Figure 4.  MMPL3 质子传递通道的口袋分区（SQ109：洋红色棒；AU1235：绿色棒；ICA38：橙色棒；Rimonabant：黄色棒)

小M的小思考：

此外，为了研究抗药突变对抑制剂结合的影响，作者分析了 13 个已知的 SQ109、AU1235 和ICA38 衍生物突变位点，其中，Y257C 是暴露于SQ109 和AU1235 的双抗性突变。MST 数据显示，这些抑制剂和突变蛋白的结合非常弱，这是因为 Tyr257 在稳定亲水性 S4 亚位点和增强 S5 亚位点与抑制剂结合中发挥了重要作用。同样的，Ser293 突变为丙氨酸严重破坏了 SQ109 和 AU1235 与MMPL3 靶蛋白的结合。诸如此类的突变如何产生耐药性仍有待进一步研究，但避免与这些产生耐药性的突变残基直接接触是设计 MMPL3 二代抑制剂的一个合理策略，而另一个策略则是设计药物构象时注入灵活可变性（例如，更自由的可旋转键）[1]。

参考文献

[1] Tuberculosis.WorldHealth Organization. 16 February 2018. https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/tuberculosis.

[2] Zhang B，etal. Crystal Structures of Membrane TransporterMmpL3, an Anti-TB Drug Target.Cell. 2019 Jan 24; 176(3):636-648.e13.

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Rimonabant(SR141716) 是中心大麻素 1 (CB1) 受体高效的、选择性的反向激动剂， Ki 值为 1.8 nM。Rimonabant (SR141716) 也能够抑制分枝杆菌膜蛋白3 (MMPL3).