蛋白质含量测定的方法有哪些

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在生物技术药物研发中，蛋白质含量测定是其质量控制的重要指标之一，蛋白质含量测定的准确性对产品规格、分装量具有指导意义，是比活性计算、残留杂质的限量控制以及其他理化特性测定的基础，也是临床前安全和有效性评价研究中有效剂量、毒性剂量设置以及临床方案制订的重要依据。常见的蛋白质含量测定方法主要有双缩脲（Biuret 法）、Lowry法、BCA法、紫外吸收法、凯氏定氮法、ELISA法和HPLC法等等。

（1）双缩脲（Biuret 法）

双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。该方法适用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

生物技术药物作为医药领域研究的重要成果和本世纪最具发展潜力的高新技术产业,已为人类的疾病防治带来更多的手段。蛋白质的纯度检查是重组蛋白质类药物的重要指标之一。美迪西生物技术药物生物分析部提供全面符合FDA/CFDA GLP标准的专业技术服务，以支持蛋白药物、抗体药物、疫苗和生物标记物的筛选与开发，及其临床前研究和临床研究。

（2）Lowry法

Lowry 法测定蛋白质含量的原理是蛋白质在碱性溶液中肽键与Cu2+鳌合，形成蛋白质-铜复合物，还原酚磷钼酸，产生蓝色化合物，蓝色深浅与蛋白质浓度呈线性关系，在一定条件下，蓝色深度与蛋白量成正比。过去此法是应用最广泛的一种方法，近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。

（3）BCA法

BCA检测法是Lowry测定法的一种改进方法，是近年来广泛应用的蛋白质定量方法。与Lowry方法相比，BCA法的操作更简单，试剂更加稳定，几乎没有干扰物质的影响，灵敏度更高（微量检测可达到0.5μg/ml），应用更加灵活。

其原理是，在碱性环境下蛋白质与二价铜离子络合并将二价铜离子还原为一价铜离子。BCA与一价铜离子结合形成稳定的蓝紫色复合物。该复合物在562 nm处有较高的吸光值，并与蛋白质浓度呈正比。不方便的是这种方法需要提前制作标准曲线。

（4）紫外吸收法

紫外-可见吸收光谱法又称紫外-可见分光光度法,它是研究分子吸收190nm～750nm波长范围内的吸收光谱，是以溶液中物质分子对光的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。

（5）Bradford

考马斯亮兰法(Bradford法)于1976年由Bradford建立，是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。据网上资料报道，其原理是考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置(lmax)，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合，在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。

这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。

（6）凯氏定氮法

样品经加硫酸消化使蛋白质分解，其中氮素与硫酸化合成硫酸铵。然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸液吸收后，再用盐酸或硫酸滴定根据盐酸消耗量，再乘以一定的数值即为蛋白含量。

（7）ELISA法

ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。该方法不仅可以用来测定体液中的各种蛋白质，包括含量极少的蛋白质如甲胎蛋白等，还可以测定激素，包括小分子量的甾体激素等，还可以用来测定抗生素和药物、病原体抗原、HBsAg、HBeAg，也利用纯化的抗原检测标本中的抗体，例如抗-HBs等。

（8）HPLC法等

HPLC法在药品定性、定量分析中的应用很广泛了，还可以应用于蛋白质含量测定。如在研究重组人粒细胞集落刺激因子 (rhG CSF)成品蛋白质含量测定方法一文中，研究者用三氯醋酸 Lowry法和高效液相色谱外标法测定rhG CSF成品蛋白质含量。结果两种方法均能有效排除rhG CSF成品中甘露醇的干扰 ,与经典的Lowry法相比 ,蛋白质的回收率均大于 96 % ,RSD均 <5 %。结论三氯醋酸 Lowry法和高效液相色谱外标法均可用于测定rhG CSF成品的蛋白质含量 ,高效液相色谱法操作更简便 ,更准确。

总之，对于生物技术药物研发中的蛋白质含量的测定来说，可以使用的方法有很多，但每种方法都有其特点和局限性，因而需要在了解各种方法的基础上根据不同情况选用恰当的方法，以满足不同的要求。