摘要聚合酶链式反应(Polymerase ChainReaction,PCR)是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的新方法。该方法一改传统分子克隆技术的模式,不通过活细胞,操作简便,在数小时内可使几个拷贝的模板序列甚至一个DNA 分子扩增 107~108 倍,大大提高了 DNA 的得率。在 PCR 反应过程中,Taq 酶对 PCR定量检测结果起到很大的影响。本文重点探讨 Taq 酶对 PCR 定量检测结果的影响。
P C R 的发展可以说起源于 D N A 合成酶的发现。DNA合成酶最早于1955年发现 (DNA polymerase I),而较具有实验价值及可得性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow所发现,但由于此酶极易被热所破坏,因此不符合一连串的高温连锁反应所需。从基因修复复制 (DNA repair replication)得到启发,Dr. Kjell Kleppe于1971年首次发表了第一篇 PCR 反应的实验论文,提出了 PCR的原始雏形概念。但由于当时受所使用的DNA合成酶的对热不稳定性限制,只能进行类似PCR前两个周期反应的单纯且少量的基因复制[1]。1976年从热泉Hot spring中的细菌(Thermus Aquaticus) 分离出来Taq polymerase是现今所使用的酶的雏形,它的耐高温的特性符合 PCR 的反应要求,但其应用于 PCR 技术直至 PCR技术理论的成型又在其后进行了多年的探讨[2]。1985 年,Dr. Kary B. Mullis经多年的研究论证并与 Saiki等人发表了 PCR 技术应用的论文。此后,PCR 技术的发展日趋完善,应用的范畴日趋扩展。直至 1995 年由美国 PE公司首先研制成功了荧光定量 P C R (也称 T a q M a n PCR,以下简称 FQ-PCR)检测仪,它融汇了 PCR的灵敏性、D N A 杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点,并能做到电脑同步跟踪,数据自动化处理,直接探测PCR过程中的变化以获得定量的结果,实现了完全闭管操作。
聚合酶链式反应(PCR:Polymerase Chain Reaction)是利用 DNA片段两端的两个短的单链引物,应用热稳定的聚合酶,通过双链 DNA模板的热变性、引物退火和引物延伸的重复循环,在体外对特定核苷酸片断进行指数级扩增的技术。早期的PCR技术在扩增反应结束之后,可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析,也可以通过光密度扫描来进行半定量的分析。无论定性还是半定量分析,分析的都是PCR 终产物。此时的定量 PCR 技术的难点主要在于:
1)如何确定 PCR 正处于线性扩增范围内。因为只有在此范围内 PCR 产物信号才与初始模板的拷贝数成比例。
2)一旦线性扩增范围确定以后,如何找到一个合适的方法检测结果。因为在许多情况下,我们所感兴趣的是未经 PCR信号放大之前的起始模板量。为了保证线性,研究者要扩增一系列梯度稀释的 cDNA或者对每个基因的扩增循环数作适当的调整,在这种需求下荧光定量 PCR 技术应运而生。
FQ-PCR即在普通的 PCR 反应中加入荧光修饰的探针,探针标记除用 TET 和 FAM 外,还可用HEX、JOE作为报告荧光,3′端的淬灭基团常用TAMRA。在探针保持完整时,荧光报告基团的荧光被荧光抑制基团淬灭,而在探针被切断后,荧光报告基团才发出报告荧光,且荧光的强度与PCR 产物的数量呈正比。随着 PCR 反应的进行,PCR反应产物不断累计,荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环,荧光检测仪器透过PCR管壁能直接检测到一个荧光信号的波长和长度变化。这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,实时得到一条荧光扩增曲线(参见图1,使用北京英贤仪器有限公司实时荧光定量PCR 分析仪INCE-8000),因此也称之为 Real-time-PCR(RT-PCR)。RT-PCR 的应用范围很广泛,包括mRNA 表达的研究、DNA 拷贝数的检测、单核苷酸多态性(SNPs)的测定等。
PCR 本身虽然是一个单纯的实验技术,即 PCR反应中各种成份在变性、退火、延伸的温度循环中,对 DNA模板进行指数级扩增。因此,变性、退火、延伸的温度高低及时间长短,反应中的各种成分( T a q . Polymerase,primers, dNTPs, MgCl2 )的浓度及纯度、性能都影响着 PCR 增幅的效果。