测序方法: 一代测序:
即Sanger测序法,核酸模板在DNA聚合酶、引物、4 种单脱氧核苷三磷酸(dNTP,其中的一种用放射性P32标记)存在条件下复制时,在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸(ddNTP),因为双脱氧核苷没有3’-OH,所以只要双脱氧核苷掺入链的末端,该链就停止延长,若链端掺入单脱氧核苷,链就可以继续延长。如此每管反应体系中便合成以各自的双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后,分4个泳道进行凝胶电泳,分离长短不一的核酸片段,长度相邻的片段相差一个碱基。经过放射自显影后,根据片段3’端的双脱氧核苷,便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。 二代测序(NGS): 将基因组DNA打碎成约100-200个碱基的小片段,在片段的两个末端加上接头 ( adapter )。将DNA片段变成单链后通过接头与芯片表面的引物碱基互补而使一端被固定在芯片上。另外一端随机和附近的另外一个引物互补,也被固定住,形成桥状结构。通过30轮扩增反应,每个单分子被扩增大约1000 倍,成为单克隆的DNA簇,随后将DNA 簇线性化。在下一步合成反应中,加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP。在DNA合成时,每一个核苷酸加到引物末端时都会释放出焦磷酸盐,激发生物发光蛋白发出荧光。用激光扫描反应板表面,在读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类后,将这些荧光基团化学切割,恢复3’端黏性,随后添加第二个核苷酸。如此重复直到每条模板序列都完全被聚合为双链。这样,统计每轮收集到的荧光信号结果, 就可以得知每个模板DNA片段的序列。
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