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5楼
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楼主 |
发表于 2015-5-28 16:05:14
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来自 重庆
提高CRISPR-Cas9特异性
为了减少CRISPR-Cas9的脱靶效应,人们开发了一系列策略。研究者们用成对的sgRNA引导Cas9切口酶变体,在sgRNA结合的地方造成单链切口(SSB),两个相邻的单链切口会形成一个DNA双链断裂(DSB)。而单个sgRNA造成的SSB能通过碱基切除修复得到精确修复,不引入插入或缺失突变。
研究者们还对Cas9进行了基因工程改造,让其依赖二聚化才能酶切,就像锌指核酸酶(ZFN)和TALEN那样。研究显示,dCas与Fok1核酸酶融合之后,DSB形成依赖于FokI的二聚化。二聚化酶对序列的要求更为严格,可以大大减少脱靶位点的数量。Cas9-FokI单体无法进行酶切。
人们还发现,适当截短sgRNA可以减少脱靶事件,同时不牺牲正确编辑的效率。只需要缩短gRNA靶标区域的长度,就可以使脱靶突变大幅减少。研究表明,17/18个核苷酸的靶向区域能够比全长gRNA更有效地靶向预定序列。
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