关于临床药理学比较全面的介绍

韩敏

6 血药浓度-时间曲线下面积(area under concentration-time curve,AUC)



血药浓度-时间曲线与横坐标间所围成的面积即为AUC（图1-1）。它是药物生物利用度的主要决定因素。AUC反映药物的吸收程度，在连续给药时比吸收速度更为重要。AUC的计算可采用积分法或矩形法，一般要计算3个以上血浆半衰期以减少误差，如果利用尿药排泄量计算AUC，通常要求收集7个半衰期的尿样。

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临床药代动力学研究的实验设计



1.1 受试者的选择 药物药代动力学过程受多种因素的影响，具有明显的个体差异，设计实验和选择受试者时应充分考虑到年龄、性别、体重、体表面积、健康状况、昼夜节律、饮食结构、营养状况、是否吸烟与嗜酒、活动状况、环境及遗传因素以及药物相互作用等因素，尽可能排除那些可能明显影响实验结果的因素。



1.2 样本大小及分组 药代动力学研究必须包括足够大的样本，研究结果才有意义，通常一种实验条件（如一种剂量、单次给药）需要4～6名受试者。绝大多数药代动力学研究包含10～20例对象。如果作交叉试验，至少应有12例（每组6例）。通常采用随机分组，如果比较两个制剂的生物利用度，由于受试者人数不可能很多，仅用随机分组还不够，最好采用交叉试验（cross-over design）来平衡可能存在的人体差异。



1.3&127;试验条件 所有受试者应在相同的试验条件下接受试验，要严格控制所有影响药代动力学过程的因素，如口服给药前的禁食时间、试验期间的食物类型、进食时间、体力活动的强度等。



1.4 预试验 在正式试验前应在少数试验对象中进行预试验，为正式试验选择适当的试验条件、剂量、给药次数、取样频度、观察时间等提供依据。



1.5 剂量 一般选择与药效学研究相同的剂量进行药动学研究，因为改变给药剂量和重复给药可能引起药物代谢类型和速率的改变。如果条件允许，也可用几种不同剂量进行研究。



1.6药物剂型和给药途径 不同途径给药后的药代动力学过程是不同的，药动学研究一般应参照临床治疗时的给药途径。但是，由于静脉注射给药后的药动学计算相对简单，所得的参数可以与其他给药途径作比较，并可获得生物利用度等参数。因此，对临床治疗采用非静脉途径给药的药物，也常常同时进行静脉注射给药的药动学研究。



1.7 单次给药或多次给药 一般先进行单次给药研究求得各项药代动力学参数，然后进行多次给药研究求出蓄积参数、维持剂量、负荷剂量、给药间隔及稳态血药浓度。



1.8 研究期限 进行药代动力学或生物利用度研究时，观察时间要足够长，以保证药物能够被充分吸收并基本完成分布和消除过程，一般为4～5个药物生物半衰期。如果用尿药排泄方法来计算药动学参数或生物利用度，则观察的时间可能会更长。进行多房室模型分析时，在吸收相和分布相应各有3～4个样本，消除相至少应观察2～3个半衰期。



1.9 标本采集 采集标本（血、尿、粪便、唾液等）的时间和频度是进行药代动力学研究的重要环节，要得到精确的药时曲线就必须采集足够多的标本，若采样次数太少会使计算的误差增大，甚至无法完成计算过程。但是取样过频，难以取得受试者的配合。确定取样频度的常用方法是参考预试验所获得的药时曲线，在斜率变化大的时间段应多采集几点，而在斜率变化小的时间段采样不必太频。此外，还可参考同类药物药动学研究的方案。



1.10 标本的保存与测定 采集的标本应妥善保存至分析测定，一般置–200C保存，血样应在存放前先分离出血浆或血清。关于测定方法的灵敏度、精密度、特异性、重现性应有方法学资料。研究药物的体内动力学过程，常常不仅测定药物而且还需要测定其代谢产物，尤其是药物的代谢产物仍然具有药理活性或者药物的作用是通过其活性代谢产物而产生的情况。标本中药物及其代谢产物的分离和测定是进行药代动力学研究的关键之一，常用的分离方法有萃取、层析（柱层析、纸层析、薄板层析、凝胶过虑层析等）、电泳、高效液相等，常用的测定方法有分光光度法（包括紫外、荧光、原子吸收等）、层析法（包括定量薄层层析、气相色谱、高效液相等）、免疫分析法及微生物法等。



1.11 统计分析 在药动学参数计算中，模型的选择至关重要。给药后开始取样的时间、取样频度、试验观察时间等均影响模型的选择，同一药物取样频度高时可能符合二室模型，取样频度低时可能表现为一室模型。选择不同的房室模型所得到的药动学参数会有一定的差异，如果把三室模型当作二室处理或把二室模型当作一室处理，所得到的药物消除半衰期可能明显偏短。尽管大多数药物都非单一房室，但在给出某些特定假设的前提下，利用一室模型求得的药动学参数对临床预测血药浓度和制订给药方案仍有一定参考价值。



确定药动学参数与受试者的某项因素是否有关，可用统计学中的相关性试验来检验，参数与性别等定性变量的关系应采用X2检验确定。在生物利用度研究中，生物利用度的评价应基于可信限，即新制剂与标准制剂比较必须在一定范围内。例如，新制剂的生物利用度的95％可信限的下限不低于标准制剂生物利用度的80％，上限不高于标准制剂的120％。  

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2 统计软件在药代动力学研究中的应用



多数情况下，药代动力学特征可以用一室或二室模型导出的数学函数来描述，并由此计算药代动力学参数，计算方法一般公认采用非线性最小二乘法，也可采用图解法（诺模算图）定量分析药代动力学，求出药代动力学参数。为了使计算更快速、简便、精确，目前已有许多计算机程序用于药代动力学计算，可在大型计算机、微机或者可编程的计算器上使用，这些程序原则上包括以下功能：



⑴ 储存实验数据（如实验对象例数、给药剂量、不同时间的血药浓度等）



⑵ 将血药浓度－时间观察值拟合为合适的数学函数



⑶ 计算药代动力学参数



⑷ 打印所需资料及参数



过去许多统计程序只能在大型计算机上运行，随着PC（personal computer）微机的普及，出现了许多与大型计算机程序具有同样功能的微机程序包，推动了微机在药代动力学研究中的应用。国际通用的PCNONLIN程序我国已经引进， 中国数学药理学会也编制了微机专用的药代动力学软件（3P87），此外， 他们还编写了许多临床药理的应用程序，如用多剂量血药浓度数据求药代动力学参数的程序（MDP）、 用样本参数的均值和个体血药浓度数据求个体的药代动力学参数的程序（SSP）、用血药浓度数据及指定的约束条件求药代动力学参数程序（CCP）、用样本参数的均值及指定的约束条件估计群体药代动力学参数的程序（SCP）、用于血药浓度预报和设计给药方案的程序（DSP）等。

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3 血药浓度测定方法的必备条件



3.1 灵敏性 衡量一个方法灵敏性的标准是灵敏度（sensitivity），在实际工作中习惯用检测限（limit of detection）和最低检测浓度（minimal concentration of detection）表示一个方法的灵敏度。最低检测浓度指单位体积试样中能检测药物的最低量。检测限越小或最低检测浓度越低，则方法越灵敏。



3.2 专一性 方法的专一性（specificity）又称专属性或特异性，是指在所采用的仪器和所设定的测定条件下，测得的信号属于被测物质所特有，可用于评价杂质、药物代谢产物、合用的其它药物等对被测药物的干扰程度。样品前处理使被测药物与上述干扰测定的物质分离越完全，对测定的干扰程度越小，方法就越专一。



3.3 精密性 精密性通常用精密度（precision）来衡量，即各次测定值与其平均值间的偏差，常用偏差（deviation，d）、标准偏差（standard deviation，SD）或变异系数（coefficient of variation，CV％）表示。有时也可用测定差值范围（rang,R）即测得的最大值和最小值之间的差值表示。偏差或变异系数越小，表示方法越精密。对方法精密度的考核，通常是在不同时间、不同实验室中，对相同的几个不同浓度的标准试样进行测定，比较变异系数，如果测定样品每ml血浆含原药在μg级时，要求CV％在2～5％之内，在ng级时，要求CV％在10％左右，在pg级以下时，要求CV％在20～30％之内，若CV％数值变化符合上述标准，则说明方法是精密的。当标准曲线的浓度范围跨几个数量级时，则需取不同浓度，分别测定它们的精密度。



3.4 准确性 准确性可用准确度（accuracy）衡量，指各次测量值或其平均值攽X敀与真实值的差，此差值称误差（error）。由于真实值无法获得，故误差常用偏差来表示，真实值常用X±SD来表示，SD越小，方法的准确度越高。准确性还常用回收率衡量。在血药浓度线性范围内，取大、中、小三种不同浓度，加到空白或给药动物血浆中，测得量与加入量比较，若回收率接近100％而CV％又符合标准，说明方法既准确又精密。进行药动学研究时，一般从给药开始到药物在体内基本消除，血药浓度值相差极大，因此设计的测定方法所适用的线性范围越宽越好。

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4 常用的血药浓度测定方法



4.1 分光光度法 当药物及其代谢产物在波长200～780nm有吸收峰或有荧光发射峰时，都可选择分光光度法。其中应用较多的是紫外分光光度法和荧光分光光度法，它们的缺点是专一性差，容易受到药物代谢产物和体液中内源性杂质及其它外来物等多种成份的干扰，测定前必须提取分离。如果采用层析法分离，可提高其专一性，但操作相当繁琐。分光光度法操作简便、快速，价格低廉，在血药浓度测定中，当灵敏度要求在10-6～10-7g/ml范围时，可以选用紫外分光光度法，如苯巴比妥、氯丙嗪等。荧光分光光度法灵敏度比紫外法高，应用较多，但同样存在专一性低的问题，一般具稠环结构或长共轭烯烃化合物可发射较强的荧光，如奎尼丁，有些化合物则需要进行衍生化来增大其检测灵敏度，如普鲁卡因。目前紫外分光光度法和荧光分光光度法被广泛用作高效液相色谱仪的检测手段。



原子吸收光谱法常用于微量元素的测定，如果药物中含有某些金属元素则可用原子吸收光谱法测定，如锂盐。



4.2 极谱法 极谱法最初用于无机物和有机物的分析，经过几十年的发展，现已成为电化学分析中的一个重要分支。血药浓度极谱测定分直接法和提取法两种，凡有机分子中含有一些特殊的电化学活性基团（如硝基、亚硝基、硝酸酯、亚硝酸酯、羰基、醛基、联氮基等等）均可选用极谱法。直接法的缺点是灵敏度低、专一性差，药物的代谢产物与原药大多具有相同的电化学活性基团，因而干扰测定。提取法是用有机溶剂将药物与内源性物质分离。在各种极谱技术中，差分脉冲极谱法最适于体液药物浓度的测定，操作简便，灵敏度高，检测限为10ng/ml，但不能把原药与代谢产物分离，必须与层析法结合，才能排除代谢产物对原药测定的干扰。



4.3 薄层层析法 层析法是分析研究中最常用的分离手段，薄层层析是层析分离中应用最为普遍的方法之一，70年代以后随着薄层扫描仪的发展，其在血药浓度测定中日益受到重视，其灵敏度可达ng水平。薄层层析分离效率高，不易受溶剂和杂质的干扰，其缺点是线性范围较窄，操作技术要求较高。



4.4 气相色谱法 气相色谱法（简称GC）是以气体为流动相的色谱法，按固定相的聚集状态分为气－固色谱（GSC）及气－液色谱（GLC），按柱的粗细不同分为一般填充柱和毛细管柱两种色谱法，毛细管柱的主要优点是分离效率大大提高。可用GC测定的药物至少已有100多种，是目前使用最为普遍的血药浓度测定方法之一。缺点是操作比较复杂，使用高压气作为流动相，有一定的危险性，且对测定物质的理化特性有一定要求。GC适用于低沸点、易汽化、热稳定性好的化合物的分析，而熔点高、极性大、不易挥发、对热不稳定的药物则峰形差、保留时间长、有时甚至不易出峰，对于这类药物一般需先进行衍生化，增加挥发性和热稳定性，减少吸附，提高检测灵敏度，如苯妥英、华法令等。GC&127;常用的检测器有氢焰离子化检测器（FID）、氮检测器（N-FID）、电子捕获检测器（ECD）、质谱检测器（MSD）。FID是GC最通用的检测器，有较高的灵敏度（检测限为50ng）和很宽的线性范围，适用于药物浓度范围较宽，灵敏度要求又不特别高的药物分析。N-FID可测定含氮结构的药物，以三环类抗抑郁药为最多，ECD适用于含负电性有机物的分析，这两种检测器的灵敏性和专一性均较高，检测限前者达0.1ng，后者可达pg。当GC与质谱仪联用时，质谱仪即为GC的检测器。一般色谱技术的优势在于高效分离混合物中各组分，而质谱技术是用高灵敏的方法对单一组分提供特征的质谱，从而确定其分子结构，因此二者联用既可分离混合物，又可分析各组分的分子结构，还可测定其含量。MSD灵敏度极高，检测限为ng～pg级，特别适用于药物代谢产物的研究，但仪器附加设备多，操作条件要求高，且仪器价格昂贵，普通实验室无条件配置。



4.5 高效液相色谱法 高效液相色谱法（简称HPLC）是吸收经典的液相色谱和GC的优点发展起来的，具有分离效能高、层析时间短、灵敏度高（某些药物可达pg级）的优点，且对一些高熔点、低挥发、极性强以及对热不稳定的不易用GC分离定量的药物，均可采用HPLC进行分析，并能在室温中操作，比GC安全简便，适用于药代动力学研究和临床用药监测，若与质谱仪联用更具定性准确、定量灵敏的特点，是研究药物代谢产物的重要手段，其比GC应用更为广泛。适用于血药浓度测定的检测器有紫外吸收、荧光发射和电化学三种。紫外检测器适用于对紫外光有吸收的药物，而多数药物有紫外吸收故应用普遍，检测限为1ng。荧光检测器用于能产生荧光的药物，灵敏度比紫外检测器高，检测限为0.1 ng。电化学检测器常用于儿茶酚胺类及含酚性基团的各种药物及其代谢产物的分析，检测限为0.01ng。HPLC测定中对无紫外吸收或荧光特性的药物需要进行柱前或柱后衍生化，以提高检测的灵敏性和专一性。



4.6 免疫分析法 免疫分析法的基础是免疫反应，即抗原与抗体结合，形成抗原－抗体结合物。这种结合是疏松、可逆的，利用样品中待测药物与标记药物之间的竞争，使标记药物从标记的抗原－抗体结合物上被取代，其取代量与加入的待测药物的量相关，通过测定被取代的标记药物来定量分析待测药物。常用的免疫分析法有放射免疫法（RIA）、酶免疫法（EIA）、荧光免疫法（FIA）和游离基免疫法（FRAT）等。各种免疫法的区别在于使用的标记物以及检测取代出来的标记物的手段不同。色谱法虽有较高的灵敏度和分离能力，但样品前处理比较麻烦，难以快速取得测定结果，免疫法除灵敏度高检测限0.001ng）专一性强外，其突出优点是操作快速，能一次完成大批量试样的测定，满足临床用药过程中及时监测、及时调整用药方案的要求。



RIA灵敏度高，专一性强，取样量少，简单易行，可广泛用于体液及组织微量激素、蛋白质、维生素和药物等的测定。EIA由于标记物的多样性,使其应用范围更广且无同位素污染。在均相酶免疫测定中，因不需分离使操作更方便、快速，广泛用于抗生素、抗癫痫药、平喘药、心血管系统药等多种药物的测定和药物滥用的监测。其灵敏度稍差于FIA，标记操作和标记产物的纯化需要专门知识和技能，而且某些因素可干扰测定。FIA灵敏度和应用范围与上述两种方法相似，但荧光物质比酶稳定且无同位素污染。在治疗药物监测中，FIA应用最为广泛。其中应用较多的是荧光偏振免疫分析法（FPIA），除用于治疗药物和药物滥用监测外，还用于生化检验、内分泌检验和毒性监测。它既有荧光试剂的稳定又克服了易猝灭的缺点，操作简便，大多数药物样品无需前处理可直接进样，样品量小，仪器自动化程度高。灵敏度为0.2ng/ml。FRAT可用于鸦片类、美沙酮、巴比妥类、苯妥英、苯丙胺等药物的测定。测定可在均相中进行速度非常快（平均每个样品不超过一分钟），但由于反应液中杂质的干扰显著，使灵敏性和专一性受到影响。



4.7 微生物测定法 微生物测定法主要用于抗生素药物的测定，分为稀释法、比浊法和扩散法，前两者准确性较差，应用较多的是琼脂扩散法。即以琼脂作为固体培养基，利用抗生素在琼脂培养基内的扩散渗透作用，将标准溶液与样品溶液在相同条件下，恒温培养后根据抑菌圈的大小计算样品中抗菌素浓度。微生物测定法的特点是设备简单、成本低、操作简便、样品量少，灵敏度约为μg/ml，一般实验室均可采用，但分析周期较长，不易在短时间内获得结果。



4.8 游离药物浓度的测定 多数药物药理作用的强弱与细胞外液中的游离药物浓度成正比。一般细胞外液中游离药物浓度与血浆中总药物浓度相平衡，因此实际工作中多用血浆中药物总浓度间接反映受体反应部位的药物浓度,但游离药物的浓度更能直接代表受体部位的药物浓度。



测定游离药物浓度可用分子量截留值在5万左右的超过滤膜，用加压（2kg/cm2）过滤法或高速离心法将血清或血浆中游离的原药与和蛋白质结合的原药分离，从超过滤膜或离心液中得到游离的原药然后按血浆样品的方法进行分析测定。此方法也常用于药物血浆蛋白结合率的测定。

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表5-1 各种测定方法特性的比较



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方法 检出极限(ng) 分离能力(方法专一性)



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分光光度法



紫外分光光度法 100 －



荧光分光光度法 10 ＋－



原子吸收光谱法 1 ＋



定量薄层层析法



紫外检测器 10 ＋＋



荧光检测器 1 ＋＋



气相色谱法



氢焰检测器 1 ＋＋



氮检测器 0.1 ＋＋＋



电子捕获检测器 0.01 ＋＋＋



质谱检测器 0.001 ＋＋＋＋



高效液相色谱法



紫外检测器 1 ＋＋



荧光检测器 0.1 ＋＋＋



电化学检测器 0.01 ＋＋＋



免疫分析法



放射免疫法 0.001 ＋＋



酶免疫法 0.001 ＋＋



荧光免疫法 0.001 ＋＋



游离基免疫法 0.001 ＋＋



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5.2 药物的理化性质



① 脂溶性：以便选择合适的溶剂作提取，提高提取方法的专属性。



② 酸碱性：包括其酸碱平衡常数pKa，以便提取前将样品调节到适宜的pH,使其能更多的被提取。



③ 挥发性及热稳定性：以便判断是否可以直接应用气相色谱法或者需要制备衍生物后采用气相法以及选择色谱条件。



④ 吸收光谱性质、荧光性质及电化学特性：以便选择测定方法或者在层析法中选择适当的检测手段。