小奕说药 | 细胞培养液澄清技术简介及技术选择考量

奕安济世生物

抗体类药物的生产过程中包含多个不同机理的纯化步骤，以去除产品相关杂质和工艺相关杂质，其中澄清步骤是一步关键的固体杂质去除步骤。过去几十年中，细胞培养工艺取得了长足的进展，将蛋白表达量提升了几十倍。但是蛋白表达量提升的同时伴随着细胞密度的提升以及细胞培养液中的杂质变化，这些变化都对现有的澄清工艺带来了一定的挑战。为了更好地应对这些挑战，澄清工艺也在不断进行尝试与创新，如预处理技术优化、深层过滤器改进等等。但截至目前，还没有一种技术或手段可以应对所有的细胞澄清场景。本文将通过对现有澄清技术的总结与比较，为相关技术人员在选择澄清路线或技术时，提供一定的参考。

现有澄清技术介绍

一、连续流离心机

传统的连续流离心机为碟片式连续流离心机（DSC），设备通常为不锈钢材质。如图1所示，料液经进样管沿旋转轴进入转子底部，料液进入底部后由转子的旋转对料液进行加速，从而对料液施加离心力。由于细胞等固体杂质与澄清培养液存在一定的密度差异，细胞等固体杂质会积聚在分离器的外边缘，而澄清培养液则沿着碟片向内流动。从而实现固液分离。

对于碟片式连续流离心机来说，它的优点在于在大规模培养体积下（>5000L）成本较低，同时其也可以适用于高密度细胞培养。但是其缺点也很明显，即前期投入过大，同时没有合适的缩小模型进行相应的工艺开发和表征。

通常不锈钢连续流离心机的清洁也是一项挑战，不仅费时费力，而且会产生大量的废水需要处理。因此有些供应商开发出了一次性的连续流离心机(SUCF)，其原理是基于流体动力与离心力之间的平衡，如图1所示。料液经进样口进入，由于料液具有一定的流体动力，而料液经过离心力加速后会产生一定的离心力。离心力会把大颗粒的固体杂质保留在腔体中，而澄清培养液则流经腔体下方的出口流出，实现固液分离。

一次性连续流离心机可以很好地避免碟片式连续流离心机费时费力的清洁工艺。而且由于其剪切力较低，可以很好地保证细胞活率，因此其同样可以作为细胞截留装置适用于灌流（Perfusion）工艺以及细胞治疗领域。

目前市面上常见的连续流离心机见表1。

表1. 市面上常见的连续流离心机

二、深层过滤

深层过滤膜通常由纤维素、多孔的助滤剂（如硅藻土）以及带正电荷的离子助滤剂组成，因此深层过滤通常包含分子排阻和吸附作用两种作用机理。

传统深层过滤器的材质通常来源于天然产物，如硅藻土和纤维素等等。这些材质在实际生产过程会有一些溶出物（如β-葡聚糖等）析出在料液中，从而可能会对产品的杂质水平以及内毒素的检测产生影响。因此，有些供应商开发了全人工合成材质的深层过滤器（如密理博公司的Millistak+® HC Pro系列），以降低工艺过程中浸出物等杂质的产生。

深层过滤是目前应用最广泛的一种收获手段，可以处理从几百毫升到几千升的样品。深层过滤的可放大性也是几种收获技术里面最好的。深层过滤所需的设备投入通常要小很多。而且由于一些助滤剂的加入，使得深层过滤可以去除一些可溶性的杂质，从而降低后续纯化步骤的压力。但是深层过滤也有不足，比如在培养规模大于5000L时，耗材的成本大幅增加，使得总成本大于DSC等其他技术。同时由于在大规模培养时需要大量的深层滤膜，深层滤膜的储存、运输、安装以及废物处理均需要大量的人力以及空间。因此，深层过滤适用于培养规模较低（如低于2000L）时的收获。

高密度细胞培养对深层过滤收获工艺也是一项挑战。挑战主要表现在深层滤膜的载量降低，从而导致成本增加以及产品过度稀释。在常规的纯化工艺中，通常采用价格较为昂贵的亲和填料来捕获产品。如果产品在收获过程中过度稀释，会影响亲和填料的使用量，从而增加工艺成本。因此为了应对高细胞密度料液的挑战，料液的预处理技术也被提出用于提升传统过滤的表现和载量。预处理技术通过添加一定量的添加物改变料液中的杂质溶解度，使得杂质形成更容易被去除的聚集物，从而提升传统过滤的表现。预处理通常包含酸沉淀、磷酸钙共沉淀以及聚合物絮凝等等。预处理形成的聚集物通常可以通过大孔径的深层过滤或者其他膜过滤（如ATF等）更容易地去除。尽管这项技术可以大幅地提高深层滤膜的通量，但是目前还未在工业界广泛使用，主要的原因还是对添加物残留尤其是聚合物添加剂残留的考量。

三、微滤（MF）

微滤在收获工艺中的应用通常以交替式切向流（ATF）和切向流过滤(TFF)两种形式存在。两者均是由跨膜压差驱动，小于膜孔径的产品和杂质透过膜，而颗粒较大的细胞等杂质留在膜内部。ATF和TFF之间的差异在于流体流经的方向不同。由于微滤的成本以及工艺时间的原因，微滤很少直接用于批次培养的收获中，但非常适合用于Perfusion工艺中的细胞截留。

图1 不同收获技术的分离原理

微滤中的ATF和TFF的主要应用场景在于Perfusion工艺，这是由于其技术特点决定的。首先其可以在不损失细胞活率的情况下浓缩细胞从而实现高密度培养。其二，其透过效率相对其他技术来说较低，因此其更适用于长时间的收获工艺，如7/24运行的Perfusion工艺。微滤中需要关注的是高密度细胞培养过程可能产生大量的细胞裂解物，这些细胞碎片可能会在膜的表面形成一定的杂质层，从而导致膜的堵塞。

四、其他收获技术

Repligen开发了一种切向流深层过滤技术（TFDF），如图1所示。TFDF结合了切向流过滤与深层过滤两种技术，既可以通过TFF提高膜的载量，也可以利用深层过滤技术去除颗粒物。

目前还有一种Body feed过滤进行初级收获的技术。通过在料液中添加一定量的具有吸附作用的助滤剂（如硅藻土）可明显提高滤饼的透过性，从而使得料液可以更容易地被膜过滤掉。Body feed过滤的分离原理详见图2.

图2 Body feed过滤的分离原理

声波分离器也同样被用来应用于细胞培养液的固液分离。声波分离器通常通过声波来加速细胞等固体颗粒的沉降，从而实现细胞与澄清培养液的分离。声波分离器的缺点为高功耗以及可放大性。

表2. 市面上常见的基于声波的细胞

TFDF、Body feed过滤等技术最大的问题在于还未在工业界大规模应用。同时每种技术均还有一定的问题有待解决，如收率损失等等。TFDF的收率损失可能是由于洗滤不完全导致，而Body feed过滤的收率损失可能是由于在沉淀过程中，发生了产品共沉淀。

收获技术的选择考量

表3. 不同收获技术之间的差异

表3总结了不同收获技术在不同方面的表现。从表3中可以看出，除了MF以外，大部分的技术均需要二级过滤以去除小的颗粒物，因此大部分的收获技术均集中于初级收获技术的开发。

目前还没有一项技术可以适用于所有的应用场景。具体的技术选择还是需要基于待收获料液的实际情况（如收获体积，细胞密度等等）以及车间已有的设备（如车间是否已经配备DSC离心机等等）情况进行具体分析。W.A. Dryden 等总结了不同收获技术适用的细胞培养规模，如图3所示，可供参考。

图3 不同收获技术适用的细胞培养规模

结 语

随着国内生物技术的发展，越来越多的药物进入了临床阶段以及商业化生产阶段。不同的阶段也对应了不同的生产规模，通常早期临床阶段会选择低于1000L的反应器，而在商业化生产阶段会选择2000L以上的反应器，甚至有些厂家基于降低产品的生产成本以及不断提升的产能需求的考量，正在规划建设高达15000L的不锈钢生物反应器。生产规模的不同以及越来越多的细胞培养密度的提高对于收获工艺带来了不一样的挑战。因此，需要基于对于不同收获技术以及生产工艺的深刻理解来选择最优的收获解决方案。

奕安济世在高密度细胞培养以及相对应的收获工艺方面积累了丰富的经验，目前已成功将强化批次培养工艺放大至2000L规模。同时奕安济世下一代连续流生产工艺平台HiCB也将基于ATF的Perfusion工艺成功放大至300L规模（~10kg DS/批），从而为进一步提高生产效率以及降低产品成本打下坚实基础。

参考文献：

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4.Liu H F, Ma J, Winter C, et al. Recovery and purification process development for monoclonal antibody production[C]//MAbs. Taylor & Francis, 2010, 2(5): 480-499.

5.https://www.sartorius.com/en/products/process-filtration/cell-harvesting/ksep-systems

6.https://cn.repligen.com/technologies/tfdf/tfdf-technology