二维液相色谱测定伏立康唑血药浓度的研究

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作者

史香芬，刘帅兵，孙志勇，张晓坚 *（郑州大学第一附属医院药学部，郑州450052）

来源药物分析杂志Chin J Pharm Anal 2019,39(8)   1404-1408摘要

目的采用全自动二维液相色谱（2D-LC-UV）建立快速测定伏立康唑血药浓度的方法，并应用于临床。

方法样品去除蛋白后直接进样，待测物在一维柱AstonSC2（4.6mm   ×25mm，5μm）上初步分离，通过中间柱 Aston SH（3.0mm × 10mm，5μm）截取保留，转移到二维色谱柱 Aston SCB（4.6mm × 100mm，5μm）上进一步分离。一维流动相为VCV-1D移动相，流速0.7mL·min-1；二维流动相为OPI-1有机移动相-BPI-1 碱性移动相-MPI-1移动相（30∶48∶22），流速 1.0 mL·min-1；柱温40 ℃ ；紫外检测波长262nm。

结果伏立康唑与各杂质分离良好，在0.38~12μg·mL-1范围内呈良好的线性关系（r=0.9999），可在10min内完整出峰，方法回收率高于95%；日内、日间的精密度RSD均小于5%；稳定性试验RSD小于5%。所建立方法对79名肾移植住院患者进行了伏立康血药浓度检测共280例次，常规剂量未达到治疗浓度的占55%，超过安全浓度的占10.4%，在治疗浓度内的占34.6%。结论本方法简便快速，结果准确，稳定性良好，自动化程度高，不依赖于专门的技术人员，适用于临床伏立康唑快速检测。关键词全自动二维液相色谱；伏立康唑；血药浓度；治疗药物监测中图分类号

R917

文献标识码

A

文章编号

0254-1793（2019）08-1404-05

DOI

10.16155/j.0254-1793.2019.08.09

近年来，随着免疫抑制治疗、化疗、实体器官移植的增多，中心静脉置管术以及心脏人工瓣膜植入术等介入性治疗的开展，发生侵袭性真菌感染（invasive fungal infection，IFI）的患者人数逐年上升。伏立康唑是对氟康唑进行结构改造后合成的新型三唑类药物，属于第Ⅱ代三唑类广谱抗真菌药，伏立康唑主要对侵袭性曲霉菌、耐氟康唑侵袭性念珠菌属、足放线病菌属和镰刀菌属有很好的抗菌活性［1］ ，是治疗侵袭性曲霉病的首选药物［2］ 。伏立康唑体内代谢呈非线性药代动力学，并且受CYP 酶系的2C19、3A4、2C9 等的基因多态性影响，使伏立康唑血药浓度个体差异较大［3-6］。临床上经该酶系代谢的药物较多，联合用药对血药浓度影响较多。因此，建议进行伏立康唑的临床治疗药物监测，以便及时调整给药方案，实现个体化用药。本文采用二维高效液相色谱建立测定伏立康唑血药浓度的方法，已成功对79 名肾移植受者进行了 280 次监测，并对监测结果进行初步评析。1 材料       1.1 仪器

　FLC 2420 2D-LC-UV 系统由全自动二维液相色谱耦合仪（湖南德米特仪器有限公司）及岛津

液相色谱 LC-20AT 部件构成；GH-202 万分之一电子分析天平（AND 公司）；TDZ4-WS 低速离心机（湖南湘仪公司）；Mini-15K 微型高速离心机（杭州奥盛公司），XW-80A 旋涡混合器（上海琪特公司）；医用冰箱（合肥美菱公司）.

1.2 药品与试剂

伏立康唑对照品（批号100862-201402，含量99.7%，中国食品药品检定研究院）；VCV-1D移动相、OPI-1有机移动相、BPI-1碱性流动相、MPI-1流动相、ACP-1去蛋白剂、ACG保护剂（均购于湖南德米特仪器有限公司）；纯净水为怡宝纯净水；空白马血清（购于北京政博伟业生物科技有限公司）。

2 方法与结果       2.1 色谱条件

第一维色谱系统中，采用Aston SC2色谱 柱（4.6mm×25mm，5μm），流动相为VCV-1D移动相，流速0.7mL·min-1；采用Aston SH 转移柱（3.0mm×10mm，5μm），流动相为纯水。第二维色谱系统中，采用Aston SCB（4.6 mm×100 mm，5 μm）色谱柱，流动相为OPI-1有机移动相 -BPI-1碱性移动相 -MPI-1移动相（30∶48∶22），流速1.0mL·min-1。柱温 40 ℃，紫外检测波长262nm，采用等度洗脱，进样量200 μL。

本实验时间程序：0~1.89 min 完成样品进样和第一维色谱分离；1.90~2.85 min 目标物转移至中间柱；2.86~4.20 min 目标物转移至二维色谱；4.21~ 10.00min 目标物在第二维色谱中完成分离。

2.2 对照品溶液的配制

称取伏立康唑对照品6.00mg，用25%异丙醇水溶液溶解并定容至50mL得药物母液，质量浓度为 120 μg·mL-1，置 -20℃冰箱中保存，备用。

2.3 质控品的配制

量取“2.2”项下对照品溶液0.5mL，置于10mL量瓶中，用空白马血清定容至刻度，得高浓度质控品（6μg·mL-1）。依次配得中浓度质控品（3.6μg·mL-1）、低浓度质控品（1.2μg·mL-1）。质控品置于-20 ℃冰箱备用。

2.4 样品处理及测定

血液样品低速离心（3000 r·min-1）5min，准确吸取上层血清300μL至1.5 mLEP管中，再准确吸取ACP-1 去蛋白剂900μL至EP管中，EP管涡旋振荡1 min 后，高速离心（14 500 r·min-1）8min，取1000μL上清液至1.5mL进样瓶中，再准确吸取ACG 保护剂100μL ，震荡摇匀，备用。在“2.1”项色谱条件下，进样200μL，记录色谱图和峰面积，采用外标工作曲线法定量，将样品峰面积代入标准曲线，计算所得浓度。每次样品测定随行测1个质控品，以保证结果的准确可靠。

2.5 色谱行为和专属性

在上述“2.1”项色谱条件下，分别对空白血清、中浓度质控品（3.6 μg·mL-1）以及服药患者样本（患者服药期间，在下次给药前 30 min 内抽取静脉血，离心得血清样本）按“2.3”项下处理，按“2.1”色谱条件进行测定，色谱图见图1，血清内源性物质及其它杂质均不干扰样品的分离测定。

2.6 标准曲线及检测下限用空白马血清将伏立康唑对照品溶液稀释成系列浓度溶液（0.38、0.75、1.5、3、6、12 μg·mL-1），按“2.4”项下方法处理并测定，以质量浓度X为横坐标，峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程：Y=8.991×104X-1.332×104 r=0.999 9

参考美国临床实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）相关指南，所选线性范围（0.38~12 μg·mL-1）包含其治疗浓度参考范围和实验室危急值，满足临床测定范围的要求。

2.7 回收率与精密度取“2.3”项下高、中、低质控品，每个浓度设置6组平行，按“2.4”项方法进行处理并测定，同日进样， 计算回收率和日内精密度；每个浓度每天设置5个平行测定，取平均值，连续测定5d，考察方法日间精密度，结果见表1。
由表2结果可知，本研究建立的伏立康唑分析方法的回收率高于95%，日内、日间的精密度RSD均小于5%。该分析方法测定准确，重复性好，符合生物样品分析的要求［7］。
2.8　样品稳定性取“2.3”项下高、中、低质控品，按“2.4”项下方法处理并测定，分别考察室温放置24h、反复冻融3次以及 -20 ℃冰冻保存30d的测试样品，结果见表2。结果表明血清中伏立康唑稳定性良好，RSD均小于5%。

2.8 临床应用2017年6月—2018年6月期间，对肾移植79名住院患者进行伏立康唑血药浓度监测，共280例。参考《中国实体器官移植受者侵袭性真菌病临床诊治指南（2016 版）》［8-9］中推荐监测伏立康唑血浆浓度保持在 2~4 μg·mL-1，依据此推荐对纳入的280例监测结果进行评析。154 例结果小于2μg·mL-1，占总样本量的55.0%；97 例在推荐治疗窗（2~4 μg·mL-1）之内，占总样本量的 34.6%；29例结果高于4μg·mL-1，占总样本量的10.4%。以上结果分析，在肾移植科伏立康唑整体使用量不足，达到有效治疗浓度者仅有 1/3，临床上应予以重视，临床药师可根据治疗药物监测（TDM）结果更密切地参与伏立康唑临床用药，监测伏立康唑血药浓度对促进合理用药十分必要。
3 讨论     

本研究所用全自动二维液相色谱系统与常规二维液相色谱不同［10-15］，该二维液相色谱运用自动化的中间柱作为转移接口，中间色谱柱不仅承担了捕获与转移功能，还承担拦截功能，使目标物从共洗脱物中得以分离；在该二维液相色谱柱体系中，中间柱的特异性拦截和透过性能，可以实现多种化学结构不同的药物共柱体系测定。日常工作中，每日随机抽取1份质控品与样品随行检测，一旦发生质控偏离情况，可通过检查 LC2 条件对照品色谱图，校验 LC1 窗口状态以及观察中间柱的捕获、洗脱效果等一系列措施进行失控回溯，这是目前其他二维液相色谱无法比拟的，在长期的质量控制及运行过程中具有非常重要的意义。与其他二维液相色谱系统相比，该系统具有明显优势，样品前处理简单易行；样品测定完成后色谱柱无需清洗；流动相由于事先进行了灭菌和密封处理，可以长期放置，无需每日配置；系统采用热量智能补充技术，色谱柱通常15 min可以平衡完毕。这些技术大大节省仪器准备和维护时间，增加 TDM 的实时性能力。

方法学验证结果显示，回收率>95%。在0.38~12μg·mL-1内，具有良好的线性关系（r=0.999 9），精密度及稳定性试验均符合要求。280例临床血样监测结果，278例均在标准曲线范围内，仅有2例低0.38μg·mL-1，查明原因，为患者忘记服药所致。本研究建立的全自动二维液相色谱测定伏立康唑血药浓度的方法，具有前处理简单，测定快速，灵敏度高，准确性好，稳定性强等特点，能满足临床报告及时性、准确性和测定范围等要求，可以作为临床治疗药物浓度监测的有效方法。