对ω-转氨酶设计，以提高对(R)-(+)-1-(1-萘基)乙胺合成的催...

一两二三四_

摘要：ω-转氨酶是用于合成手性(R)-(+)-1-(1-萘基)乙胺的酶，该手性是许多手性药物的关键药物中间体。然而，ω-转氨酶对1-萘乙酮底物的低催化效率严重地限制了(R)-(+)-1-(1-萘基)乙胺的工业合成。本研究，提出一种基于结构的策略并结合计算机模拟和体外研究的方法对ω-转氨酶进行理性合计，以提高对1-萘乙酮的催化效率。在同源建模和分子对接分析的基础上，对G136、V199、S223进行了丙氨酸扫描，饱和度和组合诱变，其中双点突变体V199W/S223P的催化效率提高了8.5倍。并通过分子对接和分子动力学模拟阐明了突变体催化效率或人稳定性提高的机理。

同源建模(Homology modeling)是利用信息技术的手段，可以直接从蛋白的一级结构(氨基酸序列)预测蛋白质的高级结构(主要为三级结构)。人们可以通过使用一个或多个已知结构的蛋白(模板蛋白，template)来构建未知结构蛋白(目标蛋白，target)的空间结构。BIOVIA Discovery Studio为用户提供了一整套利用Homology modeling方法自动预测蛋白质空间结构的工具。用户只需要提供蛋白质的氨基酸序列既可以轻松完成同源模型的构建及模型可信度评估的工作。

分子对接(Molecular docking)是基于结构药物设计的核心模拟手段，依据受体与配体作用时的几何匹配和能量匹配过程，模拟受体-配体相互作用，预测两者间最佳的结合模式和结合亲和力。采用分子对接模拟技术，科研人员可以进行基于结构的药物虚拟筛选，药物分子的结构改造，配体和受体相互作用的机理研究等工作，从而大大提高实验效率。在BIOVIA Discovery Studio这一分子模拟的综合平台中，分子对接程序包含Libdock、CDOCKER、Flexible Docking，这三种对接算法各有优势，能够满足广大科研工作者的多种应用需求，为其提供配体受体间相互识别的“利器”。

对ω-转氨酶设计，以提高对(R)-(+)-1-(1-萘基)乙胺合成的催化效率

Ref：Molecular Catalysis. Accepted 14 December 2020, IF=3.687

链接：https://doi.org/10.1016/j.mcat.2020.111368

一 研究背景

手性胺是许多药物中至关重要的组成部分，通常用于手性药物的合成，例如阿尔茨海默症药物Rivastigmine，肾上腺素能拮抗剂Dilevalol，抗逆转录病毒药物Lopinavir和糖尿病药物Sitagliptin。这些手性药物的应用极大地促进了有效合成手性胺的探索。(R)-(+)-1-(1-萘基) (R-NEA)是一种重要的手性芳族胺，是关键的医药中间体和手性拆分剂。另外，(R)-和(S)-1-(1-萘基)乙胺都可以吸附在多晶铂的表面上以制备高活性手性催化剂。与传统的化学合成方法相比，生物催化是光学活性胺合成的绿色替代方案。生物催化剂通常在环境温度和中性pH下在水性介质中操作，以高效且可行的方式催化手性中间体的生物合成。在过去的几十年中，已经探索了用于手性胺合成的各种酶，其中ω-转氨酶是一种依赖于5-磷酸吡哆醛的酶，催化从氨基供体到受体的氨基转移反应，用于合成手性氨基酸或胺，与其化学对应物相比，它为还原胺化提供了更简洁的途径。并且已采用多种方法对ω-转氨酶的进行了改造，其中包括半理性设计策略。

二 研究过程

在这项研究中，利用节杆菌KNK168 (ArTA) ω-转氨酶催化1-萘乙酮合成R-NEA。为ω-转氨酶对1-萘乙酮的催化效率，我们采用基于结构的工程策略与丙氨酸扫描和组合诱变对ω-转氨酶进行改造。首先，为确定关键的氨基酸残基，我们采用BIOVIA Discovery Studio中CDOCKER将1-萘乙酮底物对接至ArTA (PDB ID：3WWH)中，如图1a所示。对接结果表明，1-萘乙酮通过氢键和疏水与ArTA相互作用 (图1b)。并且底物结合口袋由两个口袋组成，一个在甲基周围的小口袋和一个在萘基周围的大口袋。1-萘乙酮5Å范围内有16个氨基酸残基，排除高度保守的6个残基(H62，V69，W156，W192，G224和A284) (图1c和d)。其次，对剩余10个关键残基(即L61，F122，T134，P135，G136，Y150，Q155，I157，V199和S223)进行丙氨酸扫描，并测量其对1-萘乙酮的活性。与WT相比，变体G136A，V199A和S223A表现出更高的活性。为了进一步研究位点136、199和223的作用，进行了饱和诱变。其中有13个突变体的活性增强，包括G136变体(例如G136I，G136A，G136Y和G136F)，V199变体(例如V199W，V199I，V199A和V199 M)和S223变体(例如S223P，S223F，S223I，S223A和S223V)。但是在每个位点的变体中G136I，V199W和S223P表现出最高的活性。

为了进一步研究136、199和223个位点的协同效应，对变体(G136I，V199W和S223P)进行了组合诱变。经实验结果表明单点突变体(V199W)，双点突变体(V199W/S223P)和三点突变体(G136I/V199W/S223P)活性较高，并分别指定为M1，M2和M3。最后，为深入了解WT及其变体的催化机理，我们使用BIOVIA Discovery Studio中Homology model构建出了ArTA的突变体并进行了分子对接。结果显示，突变体M1，M2和M3与WT相比具有更高的催化效率是因为酶与1-萘乙酮底物之间的疏水作用增强了。此外，使用BIOVIA Discovery Studio计算了WT (或变体)与1-萘乙酮之间的相互作用能，如表1所示。相互作用能值确定为M2<M3<M1<WT，这个与它们的比活和催化效率相对应。

三 结论

为提高ω-转氨酶催化1-萘乙酮合成R-NEA的催化效率，基于结构的策略并结合计算机模拟和体外研究的方法对ω-转氨酶进行理性合计。与野生型相比，变体M1，M2和M3的活性分别提高了1.4倍，2.6倍和1.5倍。M2的催化效率(k cat/Km)是WT的9.5倍。并通过分子对接分析了突变体催化效率的提高可归因于残基与底物之间更强的相互作用。这项研究可为针对大体积的酮底物的ω-转氨酶工程化提供有用的信息。

表1 WT (或变体)与1-萘乙酮之间的相互作用能

Enzymes	Interaction energy (kcal/mol)
WT	-194.2
M1	-341.9
M2	-407.7
M3	-366.2

图1 (a) 1-萘乙酮与ArTA结合模式图；(b) 1-萘乙酮周围的关键氨基酸残基；(c) 1-萘乙酮5Å内氨基酸残基2D图

图2 ArTA及其突变体与底物1-萘乙酮的对接模式。

(a) 关键残基与1-萘乙酮相互作用的3D图；(b)关键残基与1-萘乙酮相互作用的2D图。

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