HPLC-MS/MS测定人血浆中伏立康唑质量浓度及其生物等效性研究

hongyaozaixian

作者

向瑾,余勤△ ,梁茂植,秦永平,南峰

四川大学华西医院 临床药理研究室 (成都 610041)

来源

四川大学学报（医学版）2018，49（1）：102-106

摘要

目的 建立高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法测定人血浆中伏立康唑的方法,并进行伏立康唑片生物等效性研究｡

方法 采用双周期随机交叉自身对照试验设计,48例健康男性受试者分别单次空腹口服两种伏立康唑片200mg,采用HPLC-MS/MS法测定人血浆中伏立康唑质量浓度,以WinNonlin® 6.1软件计算主要药动学参数,并评价两种伏立康唑片的生物等效性｡

结果 伏立康唑标准曲线范围均为1~ 5000ng/mL,日内及日间精密度〔相对标准偏差(RSD)〕均小于11%,准确度在100.00% ~109.73%之间,以内标基质效应校准后的伏立康唑基质效应RSD 小于15%,萃取回收率大于50%,各项稳定性考察结果合格｡伏立康唑峰浓度(Cmax)和药-时曲线下面积(AUC0-t､AUC0-∞ )的90%置信区间在80.00%~125.00%等效区间之内,受试制剂与参比制剂间达峰时间(Tmax)差异无统计学意义(P>0.05)｡

结论 所建立的 HPLC-MS/MS方法可用于人血浆中伏立康唑质量浓度的测定,伏立康唑片受试制剂与参比制剂生物等效｡

关键词

伏立康唑 高效液相色谱－串联质谱法 血药浓度 生物等效性研究

DOI

10.13464/j.scuxbyxb.2018.01.021

伏立康唑(voriconazole,VRC)[1 -3]是新型第二代三唑类抗真菌药,为氟康唑的衍生物,在氟康唑的丙基上增加1个甲基,故增加了对目标酶的亲和力;嘧啶环及5位上的氟也增加了抗真菌的活性;因而比其它三唑类抗菌谱更广､抗菌作用更强,且耐受性较好｡在临床上应用于由念珠菌属､曲霉菌属等真菌以及一些地方流行性真菌引起的感染｡口服200mg生物利用度为90%,药代动力学呈非线性分布,可能是由肝脏的首过代谢过程中部分饱和引起的｡本品依赖细胞色素P450酶在肝脏进行代谢,主要通过细胞色素酶CYP2C19, 其次为CYP2C9和CYP3A4来完成[4]｡

目前已报道的伏立康唑血药质量浓度检测方法有高效液相色谱 (HPLC)法[5]､HPLC-串联 质谱(HPLC-MS/MS)法[6]､气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)法[7]｡由于HPLC-MS/MS法灵敏､快速､特异性高,故本研究选用HPLC-MS/MS法测定人血浆中伏立康唑质量浓度,并将其应用于两种伏立康唑片的生物等效性研究。

１ 材料与方法　1.1 药品与试剂

受试制剂:伏立康唑片(200 mg/片,重庆莱美药业股份有限公司生产,批号:1305010);参比制剂:伏立康唑 片(200 mg/片,辉瑞生产,商品名:威凡,批号:C10527540)｡

伏立康唑对照品(中国药品生物制品检定所,批号100862-200701),内标(IS)氟康唑对照品(中国药品生物制品检定所,批号100314-200503);实验中使用的甲醇､甲酸为色谱纯;磷酸二氢钾､二氯甲烷为分析纯;水由Millipore公司Milli-Q仪制备｡

1.2 主要仪器

SIL-HTc型高效液相色谱仪 (日本,岛津公司),API3000三重四极杆串联质谱仪(美国,应用生物系统公司),Analyst1.4数据工作站｡

１.3  受试者选择

临床试验方案经过四川大学华西医院医学伦理委员会审核批准｡受试者按照药物临床试验质量管理规范(GCP)规定于试验前充分知情并签署知情同意书｡本研究共纳入48例健康男性受试者,年龄为18~40岁;受试者于试验前接受体检且排除有临床意义的异常｡

１.4 给药和血浆样本采集

本研究采用双周期､随机､交叉､自身对照设计,48例筛选合格的受试者随机分为 A､B两 组,每组各24例｡受试者禁食10h后,第一周期 A 组受试者空腹口服伏立康唑片受试制剂1片,B组空腹口服伏立康唑片参比制剂1片;第二周期A组空腹口服伏立康唑片参比制剂1片,B组空腹口服伏立康唑片受试制剂1片｡两周期间的清洗期为1周｡每周期受试者于给药前及给药后0.25､0.5､0.75､1､1.5､2､3､4､6､9､12､24､48和72h,由肘静脉采集静脉血3.5mL｡采集的血样置肝素抗凝试管,离 心8min(3000r/min),分离上层血浆,置于-30 ℃冰箱保存待测｡

１.5 血浆中伏立康唑的测定

1.5.1 液相条件 分析柱为 Gemini 5u C18 (50mm×4.6mm,5μm),流动相为甲醇∶水∶甲酸=85∶15∶0.05(体积比),流速设置为0.2mL/min,柱温为室温｡

1.5.2 质谱条件 采用电喷雾离子源(ESI),多反应离子监测模式(MRM),正离子扫描｡伏立康唑和内标氟康唑的检测离子对质荷比(m/z)分别为350.2/281.1和307.2/238.1｡雾化气(NEB)设 置为9L/min;气帘气(CUR)设置为7L/min;碰撞活化气(CAD)设置为7L/min;离子源温度为400℃｡

1.5.3 样本预处理 取血浆样本50μL,加入50μL内标工作液 (氟康唑,质量浓度为100 ng /mL),加入0.01 mol/L 磷酸二氢钾溶液 (pH8)100μL,混匀后加入1.5 mL 二氯 甲烷,漩涡萃取1min,于13000r/min低温离心5min后,抽弃上层水层,转移下层有机相于45℃水浴挥干｡残留物用200μL流动相复溶,进样4μL｡

１.6 生物样本分析方法的建立和确证

1.6.1 特异性 按1.5.3样本预处理方法,分别处理并将伏立康唑和内标对照品､空白血浆样本､空白血浆加伏立康唑和内标对照品样本以及受试者样本进行进样,考察本法特异性｡

1.6.2 标准曲线 配制伏立康唑血浆质量浓度为1､2.5､5､40､200､1000､3000､5000 ng/mL的标准曲线样本,按1.5.3样本预处理方法处理,记录伏立康唑与内标的峰面积,以二者峰面积比值(y)对 相应标准曲线质量浓度(x),进行线性回归,权重系数设置为1/c2,要求r>0.99｡

1.6.3 精密度和准确度 配制伏立康唑低､中､高3个质量浓度血浆质控样品,分别为2､100､4000ng/mL,每一浓度各6份样本,按1.5.3样本预处理方法处理,日内精密度通过计算相对标准偏差(RSD)获得,准确度通过计算测定浓度与理论浓度的百分比获得;连续测定3d,考察日间精密度;要求日内及日间精密度RSD<15%,准确度在85%~115%之间｡

1.6.4 基质效应 取6个不同来源的空白血 浆50μL,按1.5.3样本预处理方法处理,残留物分别用200μL相当于低､中､高质量浓度的伏立康唑及内标混合标液复溶,进样4μL,每一质量浓度各制备3份,记录伏立康唑峰及内标峰的面积(A);同时将相应质量浓度的伏立康唑及内标混合标液直接进样4μL,记录相应样本的伏立康唑峰及内标峰的面积(B),通过 A 与B比值的百分比分别计算伏立康唑与内标的基质效应｡将伏立康唑的基质效应除以内标的基质效应后,计算比值的 RSD,得到以内标基质效应校准后的伏立康唑基质效应RSD,要求RSD<15%｡

1.6.5 萃取回收率 同1.6.3的方法配制低､中､高质量血浆质控样品,每一浓度各3份样本,按1.5.3样本预处理方法处理后进样;另取空白血浆50μL,按1.5.3样本预处理方法处理,残留物分别用200μL相当于低､中､高质量浓度的伏立康唑标液复溶,进样4μL,每一浓度各制备3份｡记 录 相应样本进样后的伏立康唑峰面积,两种处理方法的峰面积比值即为萃取回收率,要求萃取回收率>50%｡

1.6.6 稳定性 分别考察血浆样品的室温放置稳定性､长期保存稳定性和冻融稳定性｡同1.6.3的方法配制低､中､高质量浓度血浆质控样品,分别在室温放置1､3､5h,在冰冻条件下(-30 ℃)保存1､3､5､9周,在-30℃冰箱中反复冻融1､2､3次后,按按1.5.3样本预处理方法处理,用当日新配的标准曲线计算质控样品质量浓度,与0时刻质量浓度比较,要求变化率在±15%之内｡

１.7 安全性评价

评价受试者服药前后的体格、生命体征、实验室和心电图检查，同时询问并收集受试者在试验期间发生的不良事件，以评价伏立康唑片的安全性。

１.8 统计学方法

采用 PhoenixTM  WinNonlin○R 6.1软件拟合受试者单次空腹口服伏立康唑片受试制剂与参比制剂的药动学参数,并进行生物等效性的统计分析｡受试制剂和参比制剂的药动学参数峰浓度(Cmax)､药时曲线下面积(AUC0-t､AUC0-∞ )经对数转换后,进行双单侧t检验,以90%置信区间法进行生物等效性评价,等效区间为80.00%~125.00%｡达峰时间(Tmax)进行非参数检验(Wilcoxon秩和检验)｡α=0.05｡

２ 结果      ２.1 方法特异性

HPLC-MS/MS法测定人血浆中伏立康唑的色谱图见图1｡空白血浆中的内源性物质对测定无干扰;伏立康唑(VRC)和内标氟康唑(IS)的色谱峰形良好,保留时间分别为1.74､1.44min｡

２.2 标准曲线

伏立康唑在 1~5000ng/mL血药浓度范围内,线性关系良好,标准曲线方程为:y=0.0292x +0.0154 (r=0.9976),最低定量限为1ng/mL (S/N>5)｡

２.3 精密度和准确度

伏立康唑血浆质控样品的精密度和准确度考察结果见表1｡可知日内及日间精密度均小于11%,准确度均在100.00%~109.73%之间,考察结果合格｡

２.4 基质效应

伏立康唑血浆质控样品基质效应考察结果见表1｡可知内标标准化的伏立康唑基质效应RSD均<15%,考察结果合格｡

２.5 萃取回收率

伏立康唑血浆质控样品萃取回收率考察结果见表１。可知低、中、高质量浓度伏立康唑的萃取回收率均＞50％，考察结果合格。

２.6 稳定性考察测定

伏立康唑血浆质控样品室温放置1､3､5h,长期冻存放置1､3､5､9周,反复冻融1､2､3次后,伏立康唑检测质量浓度与0时刻比较,变化率均在 ±15%之内｡可知伏立康唑在上述条件下是稳定的｡

２.7 药动学及生物等效性试验

４８例受试者单次空腹口服２００ｍｇ伏立康唑片受试制剂和参比制剂后平均药－时曲线图见图２。由图２可知，伏立康唑受试制剂和参比制剂的药－时曲线基本吻合。受试制剂与参比制剂的主要药动学参数见表２。

计算受试者单次空腹口服伏立康唑片受试制剂和参比制剂200mg后,伏立康唑的Cmax､AUC0-t､AUC0-∞ 受试制剂和参比制剂之比分别为90.70%､99.31%､99.41%,90%置信区间分别为95.53%~103.23%､95.68%~103.28%､83.65%~98.35%,均在80.00%~125.00%区间范围内｡Tmax在不同制剂间差异无统计学意义(P>0.05)｡可知伏立康唑受试制剂与参比制剂生物等效｡

2.8 安全性评价

48例受试者服药前后的体格､生命体征､实验室和心电图检查均未发现有临床意义的改变｡1例受试者在服用受试制剂与参比制剂后均发生一过性的视物模糊(发生率2.08%),持续时间20min,发生程度为轻度,判断与试验药物很可能有关,未治疗自行缓解;1例受试者出现上呼吸道感染 (发生率2.08%),1周后自行恢复,判断与试验药物肯定无关｡健康受试者单次口服伏立康唑片200mg后未发生药品说明书记载外的不良反应｡

3 讨 论     本研究采用HPLC-MS/MS法测定人血浆中伏立康唑质量浓度｡ 文献报道的内标有卡马西平[5,8]､氟康唑[6]､安定[9 -10];本方法建立时参考文献比较了卡马西平､氟康唑,同时考察了化合物利多卡因,结果显示同系物氟康唑的色谱行为和萃取回收率与伏立康唑更为一致,故选其为内标｡文献报道的样本预处理方法多为沉淀蛋白法[5 -6,8,11]､液-液萃取法[9 -10],所用萃取剂多为混合萃取剂(乙 醚-二氯甲烷=3∶2),本研究考察了不同萃取剂(二氯甲烷､乙酸乙酯､正己烷､乙醚)和不同pH 萃取条件(pH6､pH7､pH8､pH9)的萃取回收率和基质效应｡综合比较,在pH8条件下选用二氯甲烷液-液萃取,萃取回收率较高,且基质效应影响较小,故确定了样本预处理条件｡