色谱法分析方法验证相关法规及注意事项

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一、相关法规要求

◆FDA cGMP211.165检验放行与销售(e)应建立和提供文件证明公司使用的检验方法的准确性、灵敏度、专属性和重复性。此验证和文件可按照211.194(a)(2)项完成。
◆ EU GMP第六章 质量控制测试   6.15  分析方法要经过验证，所有上市批准产品的测试操作都应该按照批准的方法执行。
第144条  确认和验证不是一次性的行为。首次确认或验证后，应当根据产品质量回顾分析情况进行再确认或再验证。关键的生产工艺和操作规程应当定期进行再验证，确保其能够达到预期结果。
第146条  验证总计划或其他相关文件中应当作出规定，确保厂房、设施、设备、检验仪器、生产工艺、操作规程和检验方法等能够保持持续稳定。第149条  应当根据验证的结果确认工艺规程和操作规程。
◆GMP第十章  质量控制与质量保证第223条  物料和不同生产阶段产品的检验应当至少符合以下要求：
(二)符合下列情形之一的，应当对检验方法进行验证：1.采用新的检验方法；2.检验方法需变更的；3.采用《中华人民共和国药典》及其他法定标准未收载的检验方法；4.法规规定的其他需要验证的检验方法。
(三)对不需要进行验证的检验方法，企业应当对检验方法进行确认，以确保检验数据准确、可靠；由此可见，根据法规要求，所有实验室内使用的分析方法均需要验证、确认或转移。



二、法规依据


◆USP<1224>分析方法转移<1225>分析方法验证<1226>分析方法确认<852>原子吸收光谱法<856>近红外光谱法<857>紫外-可见分光光度法<1092>溶出度方法开发与验证◆EP通则2.2.22，2.2.23，2.2.57，2.2.58，2.4.20◆ICHQ2(R1)分析方法验证文本及方法学◆中国药典四部9101  药品质量标准分析方法验证指导原则

三、注意事项

1、鉴别1.1操作步骤：※配制对照品溶液和供试品溶液，在规定的色谱条件下进样，供试品溶液中主峰的保留时间与对照品溶液中主峰的保留时间一致。※含量测定项下，供试品溶液中主峰的保留时间与对照品溶液中主峰的保留时间一致。
1.2注意事项※色谱保留时间是化合物表现的性质，但不是特有的。待测样品和对照品的保留时间一致可以用作结构鉴定的一个特征，但仅靠这一点是不够的。※同一个给定化合物的绝对保留时间在不同的谱图里可能是不一样的。
2、HPLC法含量测定2.1概述※HPLC常用于原辅料的含量测定以及制剂中含量、含量均匀度、溶出度、释放度测定。※测定方法：外标法。※测定步骤：按照检验方法，配制对照品溶液与供试品溶液，在规定的色谱条件下进样，计算含量、含量均匀度、溶出度、释放度。※验证项目：专属性、线性与范围、准确度、精密度、溶液稳定性、耐用性。※原辅料含量确认项目：专属性、精密度、溶液稳定性。※制剂含量/含量均匀度确认项目：专属性、线性与范围、精密度、溶液稳定性。※制剂溶出度/释放度确认项目：专属性、精密度、溶液稳定性。
2.2注意事项2.2.1溶出度/释放度⁎获得澄清溶液的方式：获得澄清溶液的方式：使用过程中,根据所过滤样品选择合适的滤膜过滤，如聚四氟乙烯膜（PTFE）、聚偏氟乙烯膜（PVDF）、尼龙滤膜等，溶出、紫外、液相等分析检测常用滤膜的孔径通常为0.22μm、0.45μm和0.8μm；不要使用离心的方法。⁎精密度溶液的制备方式：可通过增加转速或延长溶出时间的方式制备样品溶液。⁎回收率溶液的制备方式：原料（API）+辅料放入溶出杯中，采用与精密度相同的转速和溶出时间。⁎配制对照品溶液（STD）和样品溶液的介质：最好一致，若由于溶解度等原因不能一致，则需要考虑STD与样品溶液响应值的一致性。2.2.2过滤实验要先做，最好能与专属性结合起来，对于含量/含量均匀度/溶出度/释放度，弃去体积的多少--即吸附性是重点。2.2.3溶液稳定性也要先做，以避免溶液不稳定性时导致后续试验测得的数据无效。2.2.4在验证报告中应对验证过程发现及解决的问题进行报告，并给出编制检验方法的建议，尤其是测试结果易受分析条件的影响时。
3、有关物质3.1概述※常用于原辅料和制剂中有关物质、异构体、杂质测定。※测定方法：限度法、定量法。※限度法测定步骤：按照检验方法，配制对照品溶液与供试品溶液，在规定的色谱条件下进样，供试品溶液中待测物质的峰面积小于对照品溶液的峰面积。※定量法测定步骤：技照检验方法，配制对照品溶液与供试品溶液，在规定的色谱条件下进样，以外标法计算供试品溶液中待测物质的含量。※限度法验证项目：专属性、检出限、溶液稳定性。※定量法验证项目：专属性、定量限、线性与范围、准确度、精密度、溶液稳定性、耐用性。
3.2注意事项3.2.1过滤实验要先做，最好能与专属性结合起来，对于制剂的有关物质方法验证，滤膜的选择与弃去体积--即浸出物和吸附性是重点。3.2.2溶液稳定性也要先做，以避免溶液不稳定性时数据无效。3.2.3强制降解实验是模拟药品生产、储存和使用过程中的极端条件，如果过度降解可能造成二次降解导致物料不平衡。3.2.4强制降解实验需考虑物料守恒，如在选定波长下，降解杂质与主峰吸收波长差异较大，应考虑使用校正因子或外标法折算成杂质真实含量后再进行物料守恒计算。3.2.5强制降解实验还需观察其它波长下杂质检出情况，考虑该波长选择是否可以有效监测潜在降解杂质。3.2.6线性、准确度要从报告阈值/忽略限做起。3.2.7在验证报告中应对验证过程发现及解决的问题进行报告，并给出编制检验方法的建议，尤其是测试结果易受分析条件变量的影响时。例如，色谱柱的品牌、滤膜材质、弃去体积等。如果耐用性结果有特殊要求时，也要写入。

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整理/注册圈

作者/Lily