内酯水解酶的生化特征和突变分析

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摘要：霉菌毒素玉米赤霉烯酮（ZEN）是主要由镰刀菌属物种产生的次级代谢产物。ZEN作为食品和饲料行业的主要污染物，对人类和动物的健康都有一定的危害。当前没有有效的技术在工业过程中降解ZEN。在这项研究中，作者从美洲瓶霉菌分离到一种新型的内酯水解ZHD607，并对其进行生化表征，该酶已克隆并在毕赤酵母中外源表达。ZHD607的特征是具有中性pH值的中温内酯水解酶，在35℃和pH 8.0下显示最佳活性。根据结构和序列比对分析，从ZHD607生成的两个突变体ZHDM1和I160Y对ZEN的活性比ZHD607高2.9和3.4倍。分子动力学模拟阐明了催化活性得以提高的各种机制。这些发现加深了我们对ZHD酶家族的了解，是迈向ZEN解毒内酯水解酶工业化的重要一步。

同源建模(Homology modeling)是利用信息技术的手段，可以直接从蛋白的一级结构(氨基酸序列)预测蛋白质的高级结构(主要为三级结构)。人们可以通过使用一个或多个已知结构的蛋白(模板蛋白，template)来构建未知结构蛋白(目标蛋白，target)的空间结构。Discovery Studio为用户提供了一整套利用Homology modeling方法自动预测蛋白质空间结构的工具。用户只需要提供蛋白质的氨基酸序列既可以轻松完成同源模型的构建及模型可信度评估的工作。

分子动力学(Molecular Dynamics，MD)是分子模拟中最常用的方法之一。该方法基于分子力场，能够动态的描述分子的运动状况，继而描述生命的动态过程。分子动力学在生命科学领域中的应用非常广泛，如蛋白质折叠的机理研究、酶催化反应的机理研究、与功能相关蛋白质的运动研究、生物大分子大范围构象变化的研究等等。分子动力学方法已经成功的运用于大分子体系低能量构象的模建、X射线晶体衍射以及NMR实验结果的处理。

内酯水解酶的生化特征和突变分析

Ref：Journal of Agricultural and Food Chemistry. Accepted: November 19, 2019, IF=4.192

链接：https://doi.org/10.1021/acs.jafc.9b05853

一、研究背景

近年来，饲料和用于生产饲料的原料中的霉菌毒素污染已在全球范围内被日益发现。如黄曲霉毒素B1，玉米赤霉烯酮(ZEN)，和曲霉毒素A。ZEN是主要由镰刀菌属产生的次级代谢产物。如禾谷镰刀菌，黄色镰刀菌和谷类镰刀菌。在来自北美的31.7％的饲料样品中，ZEN的含量超过100 μg/kg。ZEN对人类和动物均有害，可以通过受污染的谷物进入生物体，并引起生殖系统疾病。ZEN的化学结构类似于β-雌二醇，是天然雌激素之一，ZEN可与雌激素受体结合。ZEN的累积和可转移特性对饲料行业构成了巨大威胁，因此迫切需要有效的方法来降解或去除ZEN。探索用于降解ZEN及其衍生物的各种方法：化学方法(酸碱处理和氧化剂消除)，物理方法(吸附、加热和加压处理)和生物方法(微生物处理)。前两种方法通过吸附或破坏内酯环和修饰基团来减少或排解ZEN。然而，这些技术仅部分有效，并且由于它们的高成本和低效率而受到阻碍。化学和物理处理还会破坏谷物和饲料的营养成分，并可能带来二次污染。而微生物降解对环境友好且具有成本效益。在微生物代谢过程中，霉菌毒素通过单个或多种酶的协同活性被水解，而且这种方法不会破坏谷物和饲料的营养成分。因此，这种方法在食品和饲料工业中显示出巨大的希望。已报道的内酯水解酶如ZHD101、ZHD518和CbZHD虽对ZEN和α-玉米赤霉烯醇有一定的水解活性，但是这些内酯水解酶的水解效率较低，不适合工业应用。在本研究中，从美洲瓶霉菌克隆了编码新型内酯水解酶的基因ZHD607，并在异源宿主巴斯德毕赤酵母中表达，然后使用定点诱变来提高ZHD607的水解效率。

二、ZHD607的表达与纯化

根据内酯水解酶RmZHD可催化ZEN中的酯键裂解，将其转化为低毒性的二羟基苯基的特性。作者对RmZHD的序列进行了分析，发现蛋白质ZHD607与RmZHD具有74%的一致性，表明ZHD607可能具有内酯水解酶的特性。因此使用密码子对其进行优化并用于克隆与表达，巴斯德毕赤酵母X33被用作产生重组ZHD607的表达宿主。之后并发现ZHD607最佳活性通常在温度30~40℃和pH 8.0~10.0的范围内。

三、突变体合理设计

尽管ZHD607和RmZHD的序列显示出74%的一致性，但它们的活性缺相差很大(分别为4940和12288 U/mg)。为了优化ZHD607的活性，作者使用序列比对、结构分析和定点诱变来确定与ZHD607活性相关的关键氨基酸，最终获得了一系列突变体(A51S、ZHDM1、I160Y、G163N、V191R、G215A/G216S、C261S和ZHDM2)，经对这些突变体的活性进行测定与比较，作者发现突变体ZHDM1和I160Y对ZEN的比活性分别为14419 ± 148.5 U/mg和16652 ± 104.1 U/mg，分别增加了2.9倍和3.4倍。

四、分子动力学模拟

为了了解催化活性口袋环境并评估ZEN与酶之间的相互作用，作者采用了Discovery Studio 2017中MD Simulations，以研究两者的结合机制。结果显示，ZHD607的活性位点的氨基酸残基与ZEN形成几个氢键(如Asn134、Tyr189、Pro194和Ser106与ZEN都形成了一个氢键)。另外，Phe244、Leu36、Ile193和Pro131与ZEN形成疏水相互作用，为酶与底物的结合提供疏水环境。由于Trp185的吲哚平面垂直于ZEN的二羟基苯甲酸环，保守残基Trp185与ZEN的芳香基团发生了疏水互作。RMSD结果表明ZHD607及其突变体ZHDM1和I160Y三个系统均在最后30 ns内达到平衡。在I160Y突变体中Pro135与Tyr160更接近，距离为8.0 Å(相对于ZHD607中的15.1 Å)。突变后，催化口袋被Tyr160覆盖并显示出闭合构象，从而使组合更稳定。为了研究Loop区的氨基酸(136~142)是否对活性产生影响，作者对ZHD607和突变体ZHDM1 Loop区的氨基酸绘制了基于MD模拟计算的均方根波动图(RMSF)，Loop区的氨基酸在ZHD607中的可塑性高于突变体ZHDM1，并比较了两种体系的构象。由于相互作用(Pro135和Leu138提供疏水接触)，突变体ZHDM1中的Loop区氨基酸(136~142)显示出较低的RMSF值，并使底物稳定在结合口袋中。ZHDM1中的部分替换使His140与Glu143相互作用，这可能有助于提高帽结构的刚性使底物稳定在结合口袋中。此外，在Arg191与His142两者之间形成阳离子π相互作用，其可以稳定侧链的构象。

五 结论

作者从美洲瓶霉菌中分离出一种新的ZEN内酯水解酶ZHD607，并在巴斯德毕赤酵母X33中表达。并且使用序列比对、结构分析和定点诱变获得了一系列突变体，发现突变体ZHDM1和I160Y的比活性中相对于ZHD607提高了2.9倍和3.4倍。另外，作者采用Discovery Studio 2017中的同源建模和MD模拟阐述了ZHD酶家族对ZEN活性催化的机制。研究表明，ZHD607，特别是其突变体(ZHDM1和I160Y)可能是工业应用降解ZEN的潜在候选者。

图1 ZHD607与I160Y在MD轨迹上的构象变化。

(a) ZHD607与底物和氨基酸残基之间的相互作用。(b) I160Y的结构全景图及160场址在整体结构中的位置。(c)两系统(ZHD607和I160Y) 135和160位置之间的距离。(d) ZHD607和(e) I160Y残基160和135的构象。

图2 ZHD607与ZHDM1构象在MD轨迹中的变化。

(a) Loop区氨基酸的结构图；(b)由ZHD607和突变体ZHDM1计算的RMSF；(c) ZHD607和(d) ZHDM1中关键氨基酸的构象。

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