冠状病毒的分子生物学研究进展

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冠状病毒属于套式病毒目(nidovirales),冠状病毒科(coronaviridae),冠状病毒属(genus:coronavirus),是病毒中的一个大家族。形态多呈圆形、有的呈椭圆形或轻度多型性,直径为80～160nm,有囊膜,囊膜表面覆有纤突,纤突末端呈球形,故整个纤突呈花瓣状或梨状,纤突之间有较宽的间隙。电镜下,囊膜纤突规则地排列成皇冠状,病毒颗粒因此而得名———冠状病毒。该类病毒感染广泛,分布于世界各地,多发生在冬春季节。目前已知并已定型的冠状病毒分为3群[1],其中第1群和第2群为哺乳动物病毒,第3群为禽类病毒。第1群冠状病毒包括人冠状病毒229E(HCoV2229E)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、犬冠状病毒(CCoV)和猫传染性支气管炎病毒(FCoV);第2群冠状病毒包括人冠状病毒OC43(HCoV2OC43)、牛冠状病毒(BCoV)、火鸡冠状病毒(TCoV)、鼠肝炎病毒(MHV)、猪血凝性脑脊髓炎病毒(HEV)和大鼠冠状病毒(RtCoV);第3群冠状病毒包括禽传染性支气管炎病毒(IBV)和火鸡蓝冠病病毒(TCoV)。目前所知,冠状病毒只感染脊椎动物,具有胃肠道、呼吸道或神经系统嗜性,与人类及动物的许多疾病有关。冠状病毒具有严格的宿主特异性,目前所发现的各种动物冠状病毒都没有对人类致病的记载,而且各种冠状病毒一般只对本宿主致病,种间传播极为罕见。另一方面,虽然冠状病毒容易变异,但就某一种冠状病毒而言,其免疫原性还是相对稳定的,即基因的变异不一定导致抗原性的显著变异。人冠状病毒有2个血清型,即HCoV2229E和HCoV2OC43,是人呼吸道感染的重要病原,人类20%的普通感冒由冠状病毒引起[2],冠状病毒也是成人慢性气管炎患者急性加重的重要病因之一。
SARS-CoV是一种新型冠状病毒,引起以肺炎为主要表现的呼吸道传染病———严重急性呼吸道综合征(severeacuterespiratorysyndrome,SARS),又称传染性非典型肺炎,该病传播快,病情凶险,死亡率高。2003年3月15日WHO将其名命为SARS,4月16日宣布该病的病原体是新型冠状病毒,并命名为SARS相关冠状病毒(theSARSassociatedcoronvirus,SARS-CoV)[3]。依据其基因及基因组特征,SARS-CoV不归属于现有的任何一个冠状病毒群,其感染患者产生的抗体可长达6个月以上,至今尚未发现SARS患者有复发现象。
随着细胞培养和分子生物学技术的迅速发展,对冠状病毒的认识逐步深入。现对冠状病毒的分子生物学研究进展作一综述。
1冠状病毒基因组结构及功能冠状病毒基因组为不分段的单股正链RNA,大小介于27～32kb之间,是所有RNA病毒中基因组最大的。病毒基因组RNA具有感染性,5′端有帽子结构,其后是65～98个核苷酸的引导序列(leaderRNA)和200～400个核苷酸的非翻译区UTR)。引导序列也存在于基因之间,又称基因间序列或转录相关序列(TAS)。3′末端有200～500个核苷酸的非翻译区(UTR)和polyA尾。基因间隔区大多由0～15个碱基组成,每个间隔区皆有一致的引导序列———5′2AA(UU)UAAAC23′,是多聚酶复合体的转录起始信号[4]。这些序列称为转录调控序列(tran2scriptionregulatingsequences,TRSs),其中高度保守的序列称为中心序列(CS),TRSs引导亚基因组mRNA的转录,在感染细胞中病毒合成5～7种亚基因组mRNA,与病毒株及宿主有关,均由正链RNA基因组复制成的负链RNA基因组转录。全部mRNA亚基因组具有相同的3′末端和65～98个核苷酸的5′端引导序列,即3′末端为典型的polyA巢式结构,5′端则长短不一(图1),除了最小的mRNA外,其他的mRNA都有2～3个ORFs(开放阅读框),是多顺反子结构,但只有在5′末端的单一序列(ORF)才具有编码功能,因此这些mRNA为结构性多顺反子,功能性单顺反子[5],分别编码结构蛋白和非结构蛋白,从基因组5′端到3′依次为5′2多聚酶2(HE)2S2E2M2N23′。基因组5′端约占RNA全长2Π3(20～22kb)的片段为基因1,由ORF1aΠb组成,编码复制酶多聚蛋白,在ORF1a和1b的重叠处有一特异性7核苷酸序列和一假结节结构,这对ORF1b的翻译是必需的。余下的3′端约占RNA全长1Π3(814～10kb)的片段编码结构蛋白和非结构蛋白[6]。非结构蛋白基因散布于结构蛋白基因之间,不同种类的冠状病毒,其非结构蛋白的数量、核酸序列、顺序以酶多聚蛋白基因的下游,有4个ORFs(开放阅读框),分别编码结构蛋白S(刺突糖蛋白)、E(小包膜蛋白)、M(膜糖蛋白)和N(核衣壳磷蛋白);在第2群和部分第3群冠状病毒中,ORF1b和S之间还有一个编码红血球凝聚素酯酶的基因,但这个基因在SARS-CoV中还没有发现。在SARS-CoV的基因间隔区,还包含5种可能的非结构蛋白(长度超过50个氨基酸)的ORFs,其中S和E之间有2个重叠的ORFs,分别为X1和X2,编码含有274和154个氨基酸的蛋白质;其他3个可能的非结构基因X3、X4、X5位于M和N之间,分别编码有63、122、84个氨基酸的蛋白质,除了上述5个编码非结构蛋白的ORFs外,在M和N之间还有两个小的ORFs,分别编码长度不到50个氨基酸的蛋白质。这些ORFs无论是在现有的核酸数据库,还是在蛋白质数据库,均搜索不到显著相似的序列,因此,这些非结构蛋白是SARS2CoV特有的,可能与SARS-CoV的毒力及致病性有关。SARS-CoV的基因组为聚腺苷酰化mRNA,长度为29727nt,GC含量为41%(其他冠状病毒为37%～42%),从基因结构上看它是一种典型的冠状病毒。SARS-CoV的复制酶多聚蛋白基因占整个基因组的近2Π3,它编码2种聚蛋白(分别由ORF1a和ORF1b编码),引导共翻译蛋白水解过程[8],在复制2冠状病毒复制酶多聚蛋白(pp1a,pp1ab)复制酶多聚蛋白(pp1a,pp1ab)由ORF1a和ORF1b共同编码,对病毒复制所需酶的加工、成熟起重要作用。较大的蛋白pp1ab通过(-1)核糖体移码机制合成,并需要一特异性7核苷酸序列和假结节结构[9],pp1a主要由辅助蛋白酶区(PLPpro,即木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶)、主要蛋白酶区(3CLpro,即胰凝乳蛋白酶,与小RNA病毒3Cpro同源)和疏水区(HD)组成。而pplab除了ppla所编码的蛋白外尚有如下结构域:RNA聚合酶、解旋酶(HEL)和锌指模序等[9]。在不同的冠状病毒中,这些结构域的数目多少和位置有所差别[4,10],切割冠状病毒多蛋白的关键酶是冠状病毒的主要蛋白酶3CLpro,3CLpro催化系统主要的催化位点是His41和Cys144,保守序列Tyr1602Met1612His162与底物的识别有关。3CLpro有一独特的C端结构域,与蛋白酶裂解活性有关,而且切割位点是保守的[11]。HCoV2229E、TGEV和MHV等的ppla有2个PLP结构域,而SARS-CoV和IBV的ppla上则只有1个PLP结构域。不同组的冠状病毒PLPpro进行酶切ppla产生的肽大小保守性较低,但酶切位点却很保守[12]。复制酶多聚蛋白自身催化水解后,通过转录因子识别5′端特定的TRS,有选择地从负链RNA上以“不连续转录”的方式转录得到全部成熟mRNA的组成部分,翻译为结构蛋白等病毒蛋白,所以复制酶多聚蛋白在病毒基因组RNA的复制、亚基因组mRNA的转录和各结构蛋白(s、E、M和N)翻译等过程中起着重要的控制作用[13]。另外,在结构蛋白基因之间还散布排列着一些非结构蛋白基因,不同种类的冠状病毒其非结构蛋白的数量、核酸序列、顺序以及表达的方式明显不同,它们对于复制是非必须的,其功能尚不完全清楚。



有些非结构蛋白可能与冠状病毒的毒力和致病性有关[14],例如ORF3a在TGEV的小蚀斑(SP)变异株及猪呼吸道冠状病毒(PRCV)都缺失,所以ORF3a编码的非结构蛋白可能与病毒的毒力有关;ORF7编码14ku的蛋白,该蛋白分子最终定位于细胞核,影响病毒的致病性,而不是在细胞培养中病毒复制及其子代病毒成熟所必需的[15]。
3冠状病毒结构蛋白冠状病毒的核心由基因组RNA、N蛋白和M蛋白的羧基末端组成,结构蛋白S、M、N和E镶嵌在膜脂质双层中,有些病毒株还有血凝素2酯酶蛋白(HE)[4]。结构蛋白S、E、M、N蛋白分别在病毒进入宿主细胞、病毒粒子的形态发生以及病毒的释放过程中发挥作用,比例在不同的毒株有所不同。
3.1S蛋白的结构与功能
S基因编码的S蛋白长约1173～1452aa,形成典型的花瓣状囊膜突起,长20nm,突出于病毒粒子表面,介导细胞吸附、膜融合以及不依赖补体的中和抗体的产生[16,17],并决定病毒的毒力及组织嗜性[18]。成熟的S蛋白为稳定的三聚体,是I型膜糖蛋白,有3个结构域,而囊膜外突出部分又可进一步分为S1、S2两个亚结构域,S1形成病毒突起的球形部分,负责病毒2宿主细胞的识别与结合,而S2可能组成了病毒突起的茎部,使蛋白锚定在病毒的囊膜中,与病毒2细胞间的融合有关[19,20]。受体通过与S蛋白结合诱导S蛋白发生构象改变,暴露穿膜有效结构域,介导病毒与宿主细胞发生膜融合。参与受体识别的结构域位于S蛋白的S1球部,当S1通过受体结合位点与宿主细胞膜受体结合以后,信号肽上酪蛋白激酶磷酸化位点(caseinkinaslIphospho2rylationsite)激活,S1上的特异基序与宿主细胞膜上相应受体结合,S1蛋白的血管紧张素转换酶2结合位点与受体血管紧张素转换酶2结合,诱导宿主细胞膜蛋白发生内陷,S1由于内部疏水作用而不稳定,导致S1和S2分子间结合力减弱,从而暴露出S2上3个螺旋(N,M,C1helix),进而由于集合作用而发生折叠,使其构象发生改变而可以穿过宿主细胞膜,使得病毒包膜与宿主细胞膜融合[19,21,22]。S1与S2之间结合力的强弱是影响冠状病毒感染性强弱的重要因素,在一些冠状病毒(如MHV及BCoV等)中,S蛋白在病毒成熟时或者成熟后先被细胞内的蛋白酶(如丝氨酸蛋白酶)切成S1和S2,然后S1和S2通过非共价方式相连接,共同构成病毒的突起。不同冠状病毒S蛋白的酶切程度不同,这与感染细胞的类型有关,虽然S蛋白是否被酶切为S1和S2两个片段对病毒包膜与宿主细胞膜融合活性不是绝对必要的[19],但S酶切成S1和S2可以促进病毒包膜与感染细胞膜之间或感染细胞之间的融合(S蛋白可存在于感染细胞的细胞膜表面),并增强病毒的感染性。部分冠状病毒(如FIPV)的S蛋白不能被切割,虽然仍能介导细胞与细胞的融合,但效率大大降低[23],可见,S蛋白的构象变化对病毒的感染起着重要作用。另外,S蛋白还在参与M蛋白和E蛋白形成的病毒包膜方面发挥重要的协同作用,S蛋白在与M蛋白相互作用的同时被有效地包装入病毒包膜中,所以S蛋白对冠状病毒的包膜形成必不可少,对病毒的出芽和胞外分泌也是必要的。
此外,S糖蛋白含有多种表位,S蛋白含有重要的病毒中和抗原表位,可使宿主产生中和抗体,这种抗体是一种细胞膜融合抑制抗体并可诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(antibody2dependentcell2mediatedcytotoxicity,ADCC);S蛋白也是诱发细胞毒性T细胞反应的主要抗原蛋白,诱导产生细胞毒性T细胞可引起严重的组织损伤[19,20]。S蛋白基因突变与病毒毒力和对宿主细胞嗜性密切相关[19～22]。总的来说,S糖蛋白主要有以下5个方面的作用:携带主要的B淋巴细胞抗原决定簇,是惟一能诱导产生中和抗体和提供免疫保护作用的结构蛋白;含有宿主细胞氨肽酶受体(APN)的识别位点,在决定宿主细胞亲嗜性方面起关键作用;决定病毒的致病性;具有细胞膜融合作用,使病毒核蛋白进入细胞质;决定病毒的血凝作用[25,26]。由于在S糖蛋白上含有宿主细胞氨肽酶受体(aminopeptidaseN,APN)的识别位点,具有细胞膜融合的作用,因此可使病毒的核衣壳进入细胞质;S糖蛋白是病毒的主要免疫原,共转译糖基化是其获得和保持抗原性所必需的,虽然碳水化合物成分不是抗原位点中的直接识别结构,但它是肽段折叠所必需的成分[27,17],因此,S基因的正确表达和折叠是冠状病毒基因工程疫苗研究的关键所在。
SARS-CoV的S蛋白缺少第2群和第3群冠状病毒的氨基酸酶切位点,所以它的S蛋白很可能不能切割成S1和S2[28],但SARS-CoV的S蛋白仍具有S1和S2相应功能,其中S1区段具备所有冠状病毒S1亲合具有相应受体细胞的功能。通过研究S蛋白的结构和功能以及与受体分子的结合模式,将有助于进一步阐明SARS-CoV的感染机制,也有利于研发抗SARS-CoV感染的药物。
3.2E蛋白的结构与功能
E蛋白为小包膜蛋白,长约76～108aa,含一个疏水的结构域,其侧面与一些带电荷的残基相连,后面跟着一个半胱氨酸的区域。在成熟的冠状病毒包膜中,E蛋白的数量远少于其他包膜蛋白,但在感染细胞靠近病毒组装部位和出芽部位以高水平表达;另外,E蛋白通过胞外区与M蛋白相互作用,使M蛋白与E蛋白定位在相同的细胞器而利于形成E和M蛋白复合体,因而使M蛋白组装进入病毒包膜中;如果这一区域缺失,将导致病毒粒子复制大量减少[30]。E蛋白N2端的疏水性氨基酸可能是作为病毒样粒子(VLPs)的包膜开始形成的支点,一旦突变,虽仍能保持E蛋白在包膜上的分布特点,但导致病毒形成流产,病毒颗粒变形,丧失了诱导病毒样粒子形成的能力;E蛋白N2末端的跨膜区缺失,同样会导致突变蛋白质的随机分布和功能不全的病毒粒子的组装,这说明E蛋白在病毒包膜和病毒粒子的形成等方面起关键作用。此外,E蛋白N2端的跨膜区在病毒脱壳、出芽过程中也起关键作用,在感染早期病毒的复制等方面也有一定的作用[30,31],因此,E蛋白在冠状病毒的形态发生和装配过程中起关键作用,E和M蛋白很可能形成病毒最小的组装机制[32,33]。
3.3M蛋白的结构与功能M蛋白是一种糖蛋白,长221～262aa,大部分的M蛋白陷于膜内,其N2亲水性末端突出于双层脂包膜的外表面,其后为3～4个疏水的跨膜结构域,在第3个疏水结构域的后面紧接着一个高度保守的氨基酸序列SwWSFNPE(SARS-CoV中的是SmWS2FNPE),其作用尚不清楚[28];C2末端亲水区位于病毒粒子内部,在病毒粒子出芽时整合进核心,与病毒核壳体相互作用,这对于维持核心结构是必需的。
M蛋白能自我相互作用,形成均一的复合体,也能与S、E、N蛋白等作用形成不均一复合体。M蛋白与这些结构蛋白相互作用,使得它们能共同组装成病毒粒子,但是M蛋白必须首先与E蛋白作用才能被装入病毒粒子,单独M蛋白是不能诱导VLPs的形成。从IBV的E蛋白与M蛋白作用证据推测,E蛋白提供一个临时的锚定位点,来部署M蛋白在前高尔基体内部的位置,这一区域的功能是准备病毒出芽的膜,同时含有M蛋白,在形成包膜的过程中M蛋白可被动地组装入病毒;实验表明当M蛋白不能组装或表达于含有E蛋白的病毒胞膜时,则病毒出芽过程不能进行;提示M蛋白穿膜部分与病毒组装和细胞内芽生有关[35]。此外,M蛋白还可诱导宿主产生特异性抗体和α2干扰素(α2IFN),并能够介导细胞融合,但这类抗体一般没有中和活性[36]。
3.4N蛋白的结构与功能N蛋白是核衣壳磷蛋白,长377～454aa,为碱性蛋白,碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸)超过酸性氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸),所有冠状病毒N蛋白N2末端均存在一个高度保守的基序FYYLGTGP。SARS2CoVN蛋白178～205aa存在一个与MHV相同的SRXX富集区,而MHV的相应区域正好是RNA结合区,因而推测该区域可能是SARS-CoVN蛋白的RNA结合区域的一部分。N蛋白有Nl和N2两个表位,其中Nl可以刺激机体产生高亲和力的抗体,在SARS患者血清中也可测到Nl特异抗体,由TGEV的N蛋白试验推测,虽然N蛋白能诱导机体产生针对N蛋白的体液免疫反应和细胞介导的免疫反应,但所产生的抗体一般没有中和活性[37]。病毒组装时,N蛋白先与病毒RNA结合形成复合体,再通过与M蛋白、E蛋白的相互作用被包裹进病毒的衣壳中,病毒通过膜出芽成熟时插入S蛋白,在M蛋白作用下,成熟的病毒体从平滑的囊泡释放出来。与许多包膜病毒从细胞质膜出芽释放不同的是,冠状病毒组装后,通过出芽进入高尔基体腔或前高尔基体相应的部位而获得包膜,出芽后病毒体通过分泌途径进入囊泡,当这些囊泡与宿主细胞膜融合时,成熟的病毒体就释放出来[38,39]。N蛋白与病毒RNA之间存在着两个相互识别作用:一个是N蛋白并不会和任意大小的病毒RNA结合,而只会和完整的病毒RNA结合;另一个是M蛋白并不会单独和N蛋白发生相互作用,而只与N蛋白和RNA的结合产物产生作用,前一个识别作用与病毒RNA中的包装信号序列(packagingsignalsequence)有关,后一个识别作用可能与某种辅助因子有关。
4SARS-CoV归属于单独的一个冠状病毒群利用美国生物信息研究所(NCBI)提供的Blast程序搜索生物分子序列数据库,对SARS-CoVTor2株核苷酸及其推导的氨基酸序列进行同源性分析,结果显示,SARS-CoV的3CLpro、PLPpro、HELpro、S、E、M、N蛋白的氨基酸序列只与几种主要冠状病毒相应蛋白的氨基酸序列之间存在同源性,其同源性分别为40%～49%、5818～6615%、5816%～6813%、2016%～2711%、20%～2217%、2218～39%和2216%～33%,而与其他病毒几乎无同源性,由此可知,SARS-CoV与其他已知的冠状病毒存在一定的同源性。分子生物学方法分析也显示,SARS-CoV基因组属于典型的冠状病毒基因型,归属于冠状病毒。但SARS-CoV与其他已知的冠状病毒的同源性都不是很高,且在系统发生上与其他3个种群的成员基本上是等距离的;另外,完整的基因组序列分析显示,SARS-CoV与其他冠状病毒之间没有明显的基因重排,也没有大的插入或缺失,这表明SARS-CoV没有大的基因片段来源于其他已知的病毒,揭示SARS-CoV不是任何一种已知冠状病毒的突变体,也不是已知冠状病毒的重组体。因此,SARS-CoV无法归于现有的任何一个种群,其基因组也没有提供其进化来源的具体信息。对SARS-CoV基因组及其功能的深入研究,将有助于SARS的致病及发生机制和预防措施的研究。
5冠状病毒研究展望冠状病毒具有广泛的组织嗜性,含有自然界最大的单股正链RNA基因组(基因组约有30kb),微基因组的克隆能力大,组织特异性强,构建的全长cD2NA转录子有传染性,子代病毒可在相应的细胞中连续传代[40],因此可将冠状病毒基因组人工改造为可携带感染性cDNA的表达载体,用于研制新的疫苗以及用于基因治疗。冠状病毒主要引起胃肠病变及呼吸系统病变,有的还引起神经组织病变,对于其基因组功能及病毒的发生和致病机制的深入研究,有助于研制适宜的抗病毒药物和疫苗,也有利于揭示和跟踪冠状病毒流行趋势,为预防像SARS这样的突发性传染病建立良好的预报预警机制。
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