最新蛋白质结构解析技术

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近来发表在《科学》（Science）杂志网络版上的研究成果表明，科学家们有史以来第一次利用超强X线激光（ultraintense x-ray laser）获得了原子级别（atomic-scale）的蛋白质结构图。这一科研新进展预示着一种新的蛋白晶体研究技术即将到来。

科学家们有史以来第一次利用超强X线激光（ultraintense x-ray laser）获得了原子级别（atomic-scale）的蛋白质结构图，这一研究成果近日发表在《科学》（Science）杂志网络版上。这一科研新进展预示着一种新的蛋白晶体研究技术即将到来。不过目前结构生物学家们还不清楚这种X线自由电子激光技术（x-ray free-electron lasers, XFEL）是否真的能够取代传统的，帮助我们解析了成千上万个蛋白质结构的以同步加速器（synchrotron）为信号源的X线蛋白晶体结构解析技术，还是只能应用于少数几个研究领域。

布氏锥虫（Trypanosoma brucei）是一种可以导致非洲睡眠病（African sleeping sickness）的单细胞寄生虫，每年大约有3万人死于非洲睡眠病，科研人员用这种新方法得到了一种能够决定布氏锥虫存亡的关键酶的蛋白晶体结构图。科学家们之前已经知道了这种半胱氨酸蛋白酶（cysteine protease cathepsin）在活化状态下的结构，新近得到的结构图则是这种蛋白以前体形式存在时的结构信息，此时该蛋白的活性位点被一个好像安全帽一样的前肽（propeptide）分子给覆盖了。这一研究成果是由位于德国汉堡（Hamburg）的德国电子同步加速器实验室（German Electron Synchrotron laboratory，DESY）的Henry Chapman和德国汉堡大学（University of Hamburg）的结构生物学家Christian Betzel以及他们的47位同事共同完成的。Betzel相信这个信息可以帮助科研人员找到或者开发出类似于这种前肽的药物，封闭这种酶的活性，杀死布氏锥虫。

Henry Chapman

不过取得这一成果的新技术和这个科研成果本身同样重要。为了得到这种半胱氨酸蛋白酶的结晶，生物学家们首先在细胞里过表达了这种蛋白，得到了宽约1微米，长约数微米的蛋白结晶。但是这种蛋白晶体还是太小，传统的环形粒子加速器（circular particle accelerators）产生的X线能量较弱，还不足以对其进行分析。于是Betzel等人就想到了美国加利福尼亚州门罗公园的美国国家加速器实验室斯坦福直线加速器中心（SLAC National Accelerator Laboratory in Menlo Park, California）的直线加速器相干光源（Linac Coherent Light Source, LCLS），这也是世界上第一台XFEL，他们希望用这台设备来解析这个蛋白小晶体的结构。

这台LCLS光源发出的X线要比同步加速器产生的X线亮数十亿倍，但是维持时间却只有短短的一瞬间，大约只有1纳秒的几百万分之一。和其它的X线蛋白晶体结构解析工作一样，这束X线在碰到构成蛋白晶体的无数个原子时也会发生散射（scatter）或衍射（diffract），这些散射角和散射强度就反映了蛋白质的晶体结构信息。但是和同步加速器发出的脉冲不同，ＬCLS发出的Ｘ线强度要高出很多，所以可以得到亚微米级（submicrometer-size）的晶体结构信息。在获得了178875个衍射图谱之后，科学家们最终获得了这个蛋白的晶体结构图。

蛋白质结构分析发现，这个前肽与布氏锥虫的半胱氨酸蛋白酶结合之后可以使这种酶失活。

LCLS于2009年正式投入使用，Chapman等人当时就已经证实这个设备可以用于蛋白质晶体结构分析。位于日本兵库县的日本理化学研究所SPring-8中心（RIKEN SPring-8 Center in Hyogo, Japan）的研究人员在今年早些时候也启动了他们自己的XFEL设备。DESY也计划在2015年开启更大规模的欧洲的XFEL设备，这也将是世界上最大的一台XFEL设备。

现在也不能确定这个技术究竟一个多么大的进步。因为并没有使用这种X线衍射数据得出蛋白质的整体结构，只是发现了它的活性位点而已。所以美国芝加哥大学（University of Chicago）的生物物理学家Keith Moffat认为这个技术只是标志了另外一种蛋白晶体结构解析方法的出现，但是现在还处于起步阶段。Moffat指出，这种X线自由电子技术的价值只有在它能够真正取代同步加速器，进行蛋白质结构解析工作时才会体现出来。

不过美国加利福尼亚州斯坦福大学（Stanford University in Palo Alto, California）的结构生物学家William Weis却发现了这种新技术的另外一种可能用途。因为在使用同步加速器分析蛋白晶体结构时虽然也会得到数据，但是蛋白晶体会被X线击碎，只不过在蛋白被击碎前发生的X线衍射让科研人员看到了蛋白质的晶体结构。所以Weis认为，如果XFEL技术有朝一日能够产生巨大的影响，那么应该是在无损蛋白结构分析方面有所作为。

另外一个问题就是使用限制的问题。一台同步加速器可以同时供几十个人使用。但是LCLS一次只能给一个人使用，即便是欧洲的XFEL设备一次最多也就可以供10个人使用。所以即便是Betzel他们这个课题组的成员在面对XFEL是否能够取代同步加速器这一问题时也会产生分歧。Betzel就提出，他个人认为这种新技术只能是对传统技术的补充，比如可以让我们对不容易形成结晶的膜蛋白等蛋白质的结构进行解析，并不能彻底取代传统的方法。但是Chapman却认为XFEL完全可以取代传统的同步加速器，而且能够完成同步加速器不能完成的任务，比如研究分子的快速改变等问题。他问道：“如果XFEL在各个方面都完胜同步加速器，为什么不能取代它呢？”

从事XFEL研究的科研人员都希望这个新技术可以快速搞定所有蛋白质的结构，可是Weis 和Moffat对此都不太乐观。

Natively Inhibited Trypanosoma brucei Cathepsin B Structure Determined by Using an X-ray Laser

Lars Redecke, Karol Nass, Daniel P. DePonte, Thomas A. White, Dirk Rehders, Anton Barty, Francesco Stellato, Mengning Liang, Thomas R.M. Barends, Sébastien Boutet, Garth J. Williams, Marc Messerschmidt, M. Marvin Seibert, Andrew Aquila, David Arnlund, Sasa Bajt, Torsten Barth, Michael J. Bogan, Carl Caleman, Tzu-Chiao Chao, R. Bruce Doak, Holger Fleckenstein, Matthias Frank, Raimund Fromme, Lorenzo Galli, Ingo Grotjohann, Mark S. Hunter, Linda C. Johansson, Stephan Kassemeyer, Gergely Katona, Richard A. Kirian, Rudolf Koopmann, Chris Kupitz, Lukas Lomb, Andrew V. Martin, Stefan Mogk, Richard Neutze, Robert L. Shoeman, Jan Steinbrener, Nicusor Timneanu, Dingjie Wang, Uwe Weierstall, Nadia A. Zatsepin, John C.H. Spence, Petra Fromme, Ilme Schlichting, Michael Duszenko, Christian Betzel, Henry N. Chapman

The Trypanosoma brucei cysteine protease cathepsin B (TbCatB), which is involved in host protein degradation, is a promising target to develop new treatments against sleeping sickness, a fatal disease caused by this protozoan parasite. The structure of the mature, active form of TbCatB has so far not provided sufficient information for the design of a safe and specific drug against T. brucei. By combining two recent innovations, in vivo crystallization and serial femtosecond crystallography, we obtain the room-temperature 2.1 Å resolution structure of the fully glycosylated precursor complex of TbCatB. The structure reveals the mechanism of native TbCatB inhibition and demonstrates that new biomolecular information can be obtained by the “diffraction before destruction” approach of x-ray free-electron lasers from hundreds of thousands of individual microcrystals.