低分子肝素研究进展

hljmingji

背景介绍 肝素是一种酸性黏多糖，由Mclean[1]首先发现其抗凝作用，Brinkous等[2]证明了其抗凝血活性，自20世纪30年代开始用于临床，经过70多年的临床研究，人们已对肝素的抗凝作用机理有了深刻的认识。随着对肝素的深入研究，特别是对以往认为无活性的低分子组分对Ⅹa因子和Ⅱa因子（凝血酶）的作用差异的认识，为开发低分子肝素提供了理论依据，20世纪70年代末，低分子肝素进入临床。[3]      低分子肝素（Low molecular weight heparin,LMWH）是由普通肝素经物理、化学或酶解聚方法而得，分子量范围为3000～8000，具有较肝素更优的抗血栓活性，且与肝素相比，出血副作用少、生物利用度高、半衰期长、抗凝效果可以预测且无需实验室监测，目前临床适应症不断扩大。历经几十年的发展，LMWH的研究已取得较大的进展。本文将就LMWH的结构与生物活性、生产制备技术、制剂的研发及质量标准作一综述。
1.LMWH的结构与生物活性
1.1 结构
    LMWH的基本结构是由二糖重复单元（糖醛酸GluA和葡糖胺GlcN）通过1,4-糖苷键连接构成的线性硫酸化多糖。二糖单元中的糖醛酸构成有葡萄糖醛酸和艾杜糖醛酸两种，连接二糖单元的 1,4-糖苷键有α、β两种构型，GlcN上的羟基可以硫酸化、乙酰化或以未保护的氨基形式存在。[4]此外，糖醛酸的组成和每个二糖单元的平均硫酸化取代度不同，又由于LMWH末端结构的差异性，分子量的多分散性，硫酸根、羧酸根带来的高负电荷性等使LMWH成为众多黏多糖中结构极其复杂的一种。对于LMWH的结构阐释，Choay等[5]提出了一种高亲和肝素的模型，同时分别列举了3种高亲和LMWH的糖单元数、分子量、作用机理及活性。                 
    分子量、硫酸化程度及其他因素与其生物活性的紧密联系，并指出为彻底了解LMWH的生物[6]该结构的阐释也是基于对LMWH生物学活性的深入研究。石峰等[7]探讨了LMWH的化学结构、活性必须了解其精确结构。至今为止，LMWH的精确化学结构仍热是研究的重点与难点。
1.2 生物活性及应用进展

    LMWH结构的多样性赋予了其独特的生物活性多样性。LMWH在临床上主要表现为抗栓活性和抗凝活性的应用。抗栓活性依赖于特殊的戊糖活性中心，抗凝活性则不仅依赖于戊糖活性中心，还与分子量有关，至少需要18个糖单元长度才能使LMWH、ATⅢ和Ⅱa形成三元复合物发挥抗凝效果。此外，LMWH的抗炎、抗肿瘤、抗病毒及其他新的生物学功能不断被发现。除抗凝抗栓作用外的其他生物活性研究也是国内外学者进一步开发LMWH的前景方向。如Haining Tan等[8]发现用聚乙二醇和LMWH修饰的ES（内皮他丁）其抗内源性血管生成活性及抗肿瘤活性增加。这是将LMWH用作修饰剂的研究。Satoko Kishimoto等[9]曾经将LMWH与鱼精蛋白混合（v:v=7:3）制备出可注射微粒。该微粒可作为肝素结合生长因子（GFs）及不同粘附细胞的载体，还可作为有效的细胞培养涂层基体。可见LMWH的应用逐渐拓展，尚待发现。相比普通肝素，LMWH的临床应用更为广泛且副作用较少，但是其抗凝活性低，且由于分子量小，不能被鱼精蛋白完全中和，同样增加了临床应用时的风险。基于此现象，开发新型LMWH成为必然之势。

1.3 新型LMWH的研制理念及研究进展
1.3.1 结构修饰的LMWH

    已证实LMWH发挥抗凝作用的特异戊糖结构中的3-O硫酸基等硫酸化基团是必需的，戊糖序列的硫酸化程度高有助于抗凝活性的发挥。针对此问题，对LMWH的结构进行改造，提高戊糖序列硫酸化程度成为其中一个开发新型LMWH的设计理念。尹晓娟等[4]较详细地列举了肝素类寡糖的合成方法。文中提到了几种硫酸化修饰方法，为LMWH的硫酸化修饰提供了参考：其一是利用N-去乙酰化酶/N-磺酸基转移酶（NDST）将GlcNAc单元上的N-乙酰基脱除并对裸露出来的氨基进行硫酸化修饰；其二是利用2-位O-磺酸基转移酶（2-OST）对IdoA 的C2-位羟基进行硫酸化；其三利用3-位和6-位O-磺酸基转移酶（3-OST 和6-OST）催化葡萄糖胺单元的C3-位和C6-位羟基引入磺酸基等方法。齐文静等[10]通过3-O-硫酸基转移酶提高了戊糖活性中心数量，从而使酶修饰反应后的LMWH抗凝活性增加了3-5倍。

1.3.2 其他新型LMWH
    与ATⅢ结合的特异戊糖序列含量可以表征抗凝活性大小，但无法被直接监测，以此为突破口，研究者用肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ控制肝素解聚，发现含有3-O-S的特异四糖序列（该四糖序列是由功能编码命名法中的±4-7双糖组成）不会被肝素酶降解，基于上述理论，通过监测控制±4-7双糖组分的含量（±4-7 组分的含量与抗 FⅩa 和 FⅡa 活性成正比）、肝素分子量长度等研制出具肝素的高抗凝活性、可被鱼精蛋白中和等优势的新型LMWH。[11]Sundaram等[12]首次进行了肝素类药物的合理设计研究，研制出了两种新型LMWH。新型LMWH可以集合肝素和LMWH的优点，保持肝素的高抗凝活性，抗FⅩa/FⅡa活性比值优于普通肝素且被鱼精蛋白中和的程度优于LMWH，减少了出血风险。
1.4 超低分子量肝素（ULMWH）的研制理念及研究进展
    超低分子量肝素（ULMWH）是在LMWH的基础上开发的又一个新品种的抗血栓药物，分子量2000～3000。与LMWH相比，其抗血栓作用强，皮下注射易吸收，无毒副作用。ULMWH具有较LMWH更高的抗FⅩa/FⅡa活性比值，因此抗栓应用比当前的LMWH有一定的优势。国外研究者很早已开始研制，国内起步较晚：如早期法国的CY222，其平均分子量为2500；意大利的OP2000，其平均分子量为2000。[13]近几年赛诺菲-安万特公司的AVE5026及ROVI公司的RI-14等。[11]ULMWH除具有一般LMWH的作用外，更重要的是抗血栓作用更突出，且几乎没有出血的风险，几乎不需要监测即足以达到安全治疗的目的。[13]此外，于天贵等[14]研究发现 ULMWH 对谷氨酸和叠氮钠诱发的大鼠皮质神经元化学损伤有一定的保护作用，这是对抗栓抗凝作用以外的活性研究。可见，ULMWH的研究是肝素类抗凝药物一个较有前景的方向。
2.制备技术研究进展
2.1 固定化酶技术的应用
    LMWH的制备方法大体分为物理分级法、化学裂解法和酶解法，目前多采用的是化学裂解法或酶解法。化学裂解法生产工艺简单、成本低廉、产品质量易于控制，常用于工业生产。与化学裂解法比，酶解法具有反应条件温和，不改变肝素结构，便于检测，硫酸化程度较高等优点，此外由于酶解法的酶切位点清晰，能够特异性地断裂肝素链上的糖苷键，因此可用于LMWH的结构测定；但同时酶解法成本较高，且酶稳定性差，对其纯化过程会造成酶活性的损失，产率降低。因而有必要改善和优化酶降解技术。
    固定化酶技术是将提纯的肝素酶固定于载体上的技术。即用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，仍能进行其特有的催化反应，并可回收和重复使用的一类技术。该技术用于肝素酶的固定化，可以克服肝素酶稳定性差，易失活，不能重复利用的缺陷，产品和肝素酶易于分离，酶可反复利用，极大的节约了成本。[6]因此，固定化酶技术备受关注。目前该技术的研究热点在于载体的开发与利用以及开发新型、高效固定化酶反应器，进一步提高转化率和生产能力。
2.2 肝素酶的高效生产技术

    目前酶解法制备LMWH采用的酶为肝素酶，它最初从肝素黄杆菌发现和分离，后来发现也存在于其他微生物及动物组织中，但商品化的肝素酶均来自于肝素黄杆菌。因此，肝素酶的高效生产技术研究是备受关注的研究课题。为达到肝素酶的高效生产，研究者寻找其他肝素酶的来源或促进肝素黄杆菌产肝素酶。高宁国[15]等从土壤中筛选到一株肝素酶的产生菌—棒杆菌 (Corynebacyerium)。陈银等[16]结合微生物基因组测序的进展对肝素酶的潜在来源进行了讨论。马小来等[17]探讨了CaCO3能促进肝素黄杆菌产肝素酶的机理。

2.3 光化学制备法的应用

    化学裂解法和酶解法是工业化生产LMWH的主要方法，但是这两种方法或反应条件剧烈，或引入刺激性化学物质，导致多糖骨架中单糖单元的分解等，这些副反应会降低产品产量与质量。因此，Kyohei Higashi等[18]采用一种新方法——光化学制备法制备新型LMWH，反应中加入了催化剂TiO2，光化学反应后可以通过离心或过滤去除，因此可制得高纯产品。得到的新型LMWH与市场上大部分LMWH（依诺肝素钠、达肝素钠等）抗凝活性相当，且通过光化学制备法制得的LMWH同时含偶数和奇数个单糖单元的寡糖片段。

3.LMWH的制剂研发

    目前LMWH只有注射剂应用于临床，注射剂疗效确切、易吸收，但半衰期短，需反复注射，且患者可能有不良反应，不宜长期用药。因此，临床上迫切需要LMWH的非注射制剂等新剂型来填补应用缺陷。利用吸收促进剂改善LMWH的口服吸收是研究最多的领域之一，此外，国内外研究者还将LMWH制成微囊、微球、脂质体等口服制剂，还有微乳制剂、聚乙二醇微粒、多聚纳米粒等其他剂型。[19]口服制剂是研究最多且前景较好的一种新剂型。希美加群是第一个口服LMWH制剂，于2004年在德国首次上市，但随着其毒副作用的出现，于2006年撤市。有关专家一直在寻找一种理想的LMWH口服制剂，同时采用各种方式以将口服制剂推广至临床。如研究者采用各种材料和技术将LMWH包裹起来，使其免遭胃液的破坏；同时为了增加其吸收，又通过减小微粒粒径，增加药物的脂溶性，中和其强负电荷和增加细胞膜的通透性等方法，将其制成胶囊、脂质体、微乳等制剂。结合最新进展的基因组学/蛋白质组学和纳米技术，有望将LMWH口服制剂逐渐完善。[20]

4.LMWH的质量标准概况

    目前我国国家药典还未收载LMWH，2005年局颁标准仅能满足BP或EP总则的要求，基本上只要求产品满足LMWH的两个最基本特征；进口注册标准和新药试行标准与BP（2012）仍有差距，杂质检测不是很严格，检测方法不够灵敏。 [21]随着对LMWH结构研究的不断深入，不断增补对LMWH末端结构的描述，USP32版的依诺肝素钠就收载了1,6-脱水结构的要求。[3]EP目前也有关于1,6-脱水结构的草案，但我国还没有，可见我国LMWH的质量标准研究需要在结构确证、杂质检测、产品分类管理等方面进一步深入。国内外质量标准仍存一定差距，因此其质量标准亟待完善。目前中检院正在承担国家药典委员会的LMWH标准提高任务，为LMWH收录到2015年版国家药典积累数据。

5.展望

    LMWH自19世纪70年代进入临床以来，发展迅猛，已经占据抗凝药物市场的大部分份额，尤其在心脑血管疾病的应用中发挥巨大的作用。肝素是其最主要的制备来源，而肝素主要是从猪或牛等哺乳动物的器官和组织中提取而来，保证肝素质量至关重要。由于生物来源的原材料的局限性，有关学者已采用生物体内或人工合成肝素的方法，人工合成肝素分化学法、酶法及化学酶法合成等。由于天然多糖结构的复杂性，化学法合成较复杂且合成率低。随着基因工程方法克隆表达相应的酶以提高酶产量等生物工程方法的发展，酶法合成肝素及肝素类似物成为一种较好的来源途径。[22]所以肝素的来源也是值得探究的领域。日本有人[23]发现一种来源于海参中的糖胺聚糖的解聚产物（DHG），不仅表现出与肝素类似的抗凝血活性，且剂量在一定范围内时，动物实验引起的出血副作用低于LMWH和普通肝素；巴西和美国研究员从虾中分离得到一种LMWH[24]，该来源的LMWH的抗凝血活性大于哺乳类动物来源的LMWH。这些研究也启发我们从哺乳动物来源外的其他来源中获取LMWH。因此，关于LMWH的研究，进一步确定其精细结构、寻找新来源及研制新剂型应用于临床等方面均是研究的热点和难点，需要各国、各界学者的不懈努力共同为LMWH的进一步开发利用贡献力量。

作者简介 1第一作者：李颖颖，女，硕士研究生，药物分析专业，电子邮箱：liyingying5988@163.com; 2通讯作者：范慧红，女，博士，研究员，生化药品质量分析，电子邮箱：shenghuayaoshi@126.com.

wuguyi99

这个发在临床不合适吧